人雄激素非依賴性前列腺癌細胞Caveolin-1基因的表達及辛伐他汀的干預(yù)研究.pdf

1、前列腺癌為西方國家最常見的惡性腫瘤，居西方國家男性所有惡性腫瘤發(fā)病率的第二位，死亡率的首位。我國前列腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，目前已位居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位。前列腺癌從發(fā)生到臨床表現(xiàn)需要長達十幾年甚至幾十年的時間。大量研究表明，正常前列腺組織發(fā)展為前列腺癌經(jīng)歷了前列腺上皮細胞內(nèi)瘤、局部前列腺癌、侵襲性前列腺癌和轉(zhuǎn)移性前列腺癌等階段。約2/3的前列腺癌患者就診時已是晚期，只能采用雄激素阻斷為主的綜合治療。阻斷雄激素能有效的緩解前列腺

2、癌癥狀，但12～18個月后，約1/3的病人前列腺癌會復(fù)發(fā)，并轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆郧傲邢侔?。目前，臨床上尚無有效的方法來治療雄激素非依賴性前列腺癌，因此對該類患者的治療已經(jīng)成為臨床關(guān)注的焦點之一。在雄激素依賴性前列腺癌細胞向雄激素非依賴性前列腺癌細胞的轉(zhuǎn)化過程中，有多種因子參與或介導(dǎo)。近年來研究表明，Caveolin-1不僅與維持膽固醇平衡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運等多種生理功能密切相關(guān)外，而且在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多方面、多環(huán)節(jié)上發(fā)揮著關(guān)鍵的

3、調(diào)控作用。新近研究發(fā)現(xiàn)Caveolin-1在前列腺癌尤其是進展期前列腺癌中呈高表達，可能參與前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展。 他汀類藥物，羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的抑制劑，是目前臨床治療動脈粥樣硬化極為重要的一類調(diào)脂藥。最近的研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物對人白血病細胞株HL-60、黑素瘤、纖維瘤、乳腺癌等多種細胞有明顯抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用。但是，他汀類藥物能否抑制前列腺癌細胞尤其是雄激素非依賴性前列癌細胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡

4、，以及是否通過Caveolin-1基因發(fā)生作用，目前尚未見相關(guān)文獻報道。本研究采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)、Westernblot法檢測人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3和PC-3m細胞系中Caveolin-1mRNA及蛋白表達情況，初步探討Caveolin-1過表達是否與前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)；采用HMA-CoA還原酶抑制劑辛伐他汀觀察其對人前列腺癌PC-3細胞增殖、凋亡及Caspase-9，8，3活性與Caveol

5、in-1表達的影響，探討辛伐他汀對人前列腺癌的作用及可能的分子機制，為臨床上前列腺癌的預(yù)防與治療提供新的理論與方法。 第一章 Caveolin-1在人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3和PC-3m細胞中的表達及意義。 目的：研究人前列腺癌PC-3和PC-3m細胞中Caveolin-1mRNA及蛋白質(zhì)的表達，分析Caveolin-1與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，探討Caveolin—1過表達在PC-3m具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性中的作用

6、，為雄激素非依賴性前列腺癌基因治療提供新靶點。 方法：以人前列腺癌PC-3和PC-3m細胞系為研究對象，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT—PCR)、Western blot法檢測Caveolin—lmRNA及蛋白質(zhì)的表達。 結(jié)果： 1．人前列腺癌PC-3和PC--3m細胞中均有Caveolin-1mRNA的表達，PC-3m細胞中的Caveolin-1表達水平明顯高于PC-3細胞，兩者有顯著性差異(P<0．05

7、)。 2．人前列腺癌PC-3和PC-3m細胞中均有Caveolin-1蛋白質(zhì)表達，PC-3m細胞中Caveolin-1蛋白質(zhì)表達量較PC-3細胞增加，兩者有顯著性差異(P<0．05)。 結(jié)論： 1．PC-3、PC-3m細胞中存在Caveolin—ImRNA及蛋白質(zhì)表達。 2．Caveolin-1過表達可能與人前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。 3．Caveolin-1可作為前列腺癌基因治療的一個靶點。

8、 第二章辛伐他汀對人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞的作用研究。 目的：觀察辛伐他汀對人前列腺癌PC-3細胞增殖、凋亡的影響，探討辛伐他汀對人前列腺癌的作用及可能分子機制。 方法：四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測PC-3細胞的增殖； Hoechst 33258染色后熒光顯微鏡法觀察PC-3細胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，并計算凋亡核百分率；Annexin V-FITC/PI雙染色，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡；Caspase活性

9、定量檢測試劑盒檢測半胱天冬特異性蛋白酶-9，8，3(Caspase-9，8，3)的活性；RT-PCR及Western blot檢測Caveolin-1mRNA及蛋白質(zhì)的表達。 結(jié)果： 1.辛伐他汀可顯著抑制PC-3細胞的體外增殖，并呈濃度和時間依賴性(P<0.05)。 2.Hoechst 33258染色顯示PC-3細胞經(jīng)辛伐他汀(20μmol/L)分別處理24h和48h后，細胞出現(xiàn)凋亡，形態(tài)學(xué)變化表現(xiàn)為凋亡細胞體

10、積縮小，核固縮，鏡下細胞核呈致密濃染或碎塊狀致密濃染。FACS檢測結(jié)果顯示，20μmol/L辛伐他汀處理12h、24h、48h后的凋亡細胞數(shù)分別為14.81±1.08％、23.42±2.33％、40.77±4.06％。PC-3細胞分別經(jīng)10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L辛伐他汀處理48h后，凋亡細胞數(shù)逐漸增多，凋亡核百分率計數(shù)分別為(11.20±3.33)％，(31.20±3.08)％，(56.24±4.50)％。FA

11、CS檢測結(jié)果顯示，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L辛伐他汀處理PC-3細胞48h后的凋亡細胞數(shù)分別為17.26±1.44％、32.45±2.56％、60.47±3.98％。PC-3細胞經(jīng)辛伐他汀(20μmol/L、40μmol/L)處理12h后，Caspase-9，8，3的活性顯著增加。 3.RT-PCR及Western blot檢測顯示10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L辛伐他汀處理48h后