熱帶果樹葉圍微生物宏基因組文庫的構(gòu)建及其生防相關(guān)基因的初步篩選.pdf

1、葉圍微生物資源是基因資源重要的一部分，運(yùn)用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)容易丟失未培養(yǎng)微生物資源，所以構(gòu)建宏基因組文庫是從分子水平探索和研究未培養(yǎng)微生物資源的有效途徑。 為充分利用微生物的多樣性資源開發(fā)新活性物質(zhì)或基因，本研究從芒果、香蕉、荔枝、龍眼、楊桃等植物上采集葉片，收集其表面附生物，利用直接提取法提取樣品基因組DNA，用Promega試劑盒純化后進(jìn)行pstⅠ部分酶切處理，電泳回收2-10kb片段，利用載體pUC19進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，克隆

2、到宿主細(xì)胞EscherichiacoliDH5a中，涂布在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，成功構(gòu)建了葉圍微生物宏基因組(Metagenome)文庫。 文庫中共含有8126個(gè)陽性克隆子，平均插入片段約3.Skb，文庫總?cè)萘考s30.1MB，若每克樣品所提取的DNA.全部轉(zhuǎn)化可得到約150000個(gè)陽性克隆，按此比例計(jì)算，文庫容量可達(dá)到0.57GB。 合成一個(gè)對植物病原真菌有拮抗基因的387bp全基因序列，用地高辛標(biāo)記后和基因組文庫

3、中的克隆進(jìn)行細(xì)胞雜交，篩選可能的抗性基因，共有34個(gè)克隆有雜交信號，通過GENBANK進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)有24個(gè)和已報(bào)道的病原拮抗菌有同源性，Y1218克隆和Chromobacteriumviolaceum有72％的同源性，Y1814克隆和Pseudomonasputida部分序列有88％的同源性，Y0140和芽孢桿菌(Bacillussp.)有80％的同源性，Y1038克隆和熒光假單孢(Pseudomonasfluorescens)有7