opaque2玉米近等基因系蛋白差異表達(dá)研究.pdf

1、玉米是重要的糧食作物和飼料作物，在我國(guó)種植面積居第一位。隨著生活水平的提高，人們對(duì)其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)越來(lái)越重視。玉米籽粒氨基酸含量較低，尤其是必需氨基酸賴氨酸含量已經(jīng)成為限制玉米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)提升的一大因素，因此提高玉米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值必需提高籽粒中賴氨酸含量。opaque2突變基因可大幅度提高玉米中賴氨酸含量，但也帶來(lái)了一些不利影響。
　　為了探究Opaque2(O2)基因在玉米基因組中的的功能，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了多對(duì)opaque2近等基因系(NILs

2、)材料，并做了一些研究。本實(shí)驗(yàn)主要是以本課題前人蛋白質(zhì)組學(xué)的研究為基礎(chǔ)，對(duì)遼2345與遼2345/o2這對(duì)近等基因系組成成分和微觀結(jié)構(gòu)、部分差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行研究。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.對(duì)遼2345和遼2345/o2近等基因系的成熟籽粒進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分分析，主要包括粗蛋白、粗淀粉、粗脂肪和總氨基酸含量以及17種主要氨基酸的含量。與遼2345相比，遼2345/o2中粗蛋白、粗脂肪和總氨基酸含量顯著降低:17種氨基酸中14種差異顯

3、著，尤其賴氨酸含量，在遼2345/o2中為0.507％，比遼2345中提高了76.5％。
　　2.對(duì)成熟籽粒和22DAP籽粒的胚乳分別進(jìn)行了掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)的觀察。觀察發(fā)現(xiàn)，遼2345胚乳淀粉粒角質(zhì)化、方形或多角型排列緊密，蛋白質(zhì)鞘狀分布于淀粉粒間隙中，籽粒充實(shí)度好，密度大，使得其呈現(xiàn)硬質(zhì)透明表型;遼2345/o2胚乳淀粉粒多裸露、圓形或橢圓形松散排列，基質(zhì)蛋白散布，籽粒充實(shí)度不好，密度小，籽粒呈現(xiàn)粉質(zhì)不透明

4、表型。
　　3.針對(duì)雙向電泳(2-DE)中篩選出12個(gè)差異蛋白點(diǎn)，對(duì)遼2345與遼2345/o2近等基因系在10DAP、14DAP、18DAP、22DAP和26DAP的籽粒胚乳進(jìn)行了熒光定量分析。結(jié)果表明，遼2345/o2中γ-zein前體基因(LOC541920)、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因（Shmt）和丙酮酸磷酸雙激酶(Ppdk)的表達(dá)量均低于遼2345;泛素結(jié)合酶基因(Ubc)、銅鋅超氧化物歧化酶基因（Sod4ap）、乳腺谷胱甘

5、肽裂解酶基因（Lgl）和蔗糖合酶基因（Sh1），在14DAP～26DAP表達(dá)量均顯著低于遼2345;同型半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶3基因(Hmt3)表達(dá)量在18DAP極顯著地低于遼2345;雙官能團(tuán)淀粉酶抑制劑基因（Chfi）表達(dá)量在授粉后五個(gè)時(shí)期均顯著高于遼2345;豆球蛋白1基因(Leg)在14DAP和22DAP表達(dá)量均極顯著地高于遼2345;山梨醇脫氫酶基因（Sdh）在14DAP極顯著地高于遼2345;ADPG焦磷酸化酶大亞基基因(S

6、h2)在26DAP極顯著高于遼2345。分析認(rèn)為，OPAQUE2(O2)可能對(duì)激活基因LOC541920、Shmt、Ppdk、Ubc、Sod4ap、Lgl、Sh1和Hmt的表達(dá)具有促進(jìn)作用，而抑制Chfi、Leg、Sdh和Sh2的表達(dá)。具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　　4.進(jìn)一步選取淀粉合成途徑中的限速酶蔗糖合酶(SuSy)與ADPG焦磷酸化酶(AGPase)進(jìn)行了酶活性的測(cè)定。結(jié)果表明，與遼2345相比，遼2345/o2中S

7、uSy活性在10DAP和14DAP較高，其他時(shí)期較低;而遼2345/o2中AGPase活性在14DAP和26DAP較高，其他時(shí)期較低。其他五對(duì)NILs材料18DAP胚乳也進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示D黃212中SuSy活性低于D黃212/o2，其他NILs均為野生型胚乳中SuSy活性較高，其中在鄭58及鄭58/02間差異不顯著:AGPase活性在五對(duì)NILs中，均為野生型胚乳中較低，其中在鄭58及鄭58/o2間差異不顯著。分析認(rèn)為O2可能能夠提

8、高SuSy活性，而抑制AGPase活性。該結(jié)果與2-DE的結(jié)果基本一致。
　　5.應(yīng)用酵母雙雜交(Y2H)驗(yàn)證O2是否能夠與Sh1和Sh2編碼產(chǎn)物互作。重組載體pGBKT7-X(X=Sh1，Sh2)分別與pGADT7-O2、pGADT7通過(guò)共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入AH109后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sh1編碼蛋白(SH1)具有自激活能力，但是與互作組比作用較弱，O2與SH1可以產(chǎn)生較強(qiáng)互作;Sh2編碼蛋白(SH2)無(wú)自激活能力，O2與SH2可以產(chǎn)生強(qiáng)互作。<

9、br>　　6.應(yīng)用酵母單雜交(Y1H)檢測(cè)O2是否能夠調(diào)控Sh1和Sh2轉(zhuǎn)錄。重組載體pLacZi-Y(Y=Sh1-1，Sh1-2，Sh1-3，Sh1-4，Sh1-5，Sh2-1，Sh2-2，Sh2-3，Sh2-4)分別與pB42AD-O2、pB42AD共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入EGY48，通過(guò)顯色培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，Sh1-1、Sh1-2和Sh2-4轉(zhuǎn)化菌株變藍(lán)，O2與Sh1-1，Sh1-2，Sh2-4共轉(zhuǎn)化的菌體也變藍(lán)且顏色更深，說(shuō)明O2能結(jié)合在這些啟動(dòng)片段