提高花生α-維生素E含量的載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、花生(Arachis hyogaea L.)是世界上四大油料作物之一，在世界范圍內(nèi)的熱帶和亞熱帶地區(qū)都有種植。中國是世界上最大的花生生產(chǎn)國和消費國。維生素E是一種脂溶性的抗氧化劑，在人體、動物以及植物體內(nèi)都有重要的生理作用。植物油是人類攝取維生素E的主要途徑。植物包括花生在內(nèi)具有高活性α-維生素E的含量非常低，為了提高花生中維生素E的含量，本研究試圖通過基因工程的辦法改良現(xiàn)有的花生品種。本文報道維生素合成途徑中的重要基因尿黑酸合成酶(V

2、E2)基因、2-甲基-6-植基-苯醌甲基轉(zhuǎn)移酶(VE3)基因和γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(VE4)基因的克隆，種子特異表達(dá)啟動子引導(dǎo)的植物表達(dá)載體構(gòu)建，以及這些載體對花生進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的研究結(jié)果。 1、為了使維生素E相關(guān)的基因在花生胚中特異表達(dá)，通過PCR的方法在同源性分別為99.8％和100％的T載體中分離得到兩個種子特異表達(dá)啟動子。它們分別是大豆種子儲藏蛋白啟動子(7S)和油菜種子儲藏蛋白啟動子(2S)。這兩個啟動子的長度分別為79

3、5bp和1058bp。 2、提取擬南芥(Arabidopsis thaliana)葉子的總RNA，并根據(jù)GenBank所發(fā)表的VE2、VE3和VE4序列設(shè)計引物，通過RT-PCR的方法分離得到這3個基因，它們和Genank上所發(fā)表的序列同源性分別為98％、100％和100％。把這三個基因分別構(gòu)建到中間表達(dá)載體pSPROK中，并且在VE2基因的上游插入7S，在VE3和VE4基因上游分別插入N2S，來調(diào)控這3個基因在種仁特異表達(dá)。然

4、后從這3個載體中酶切出分別帶有啟動子、基因和終止子的完整表達(dá)單元，構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300中，所構(gòu)建成的植物表達(dá)載體分別命名為pCAMBIA1300VE2·7S、pCAMBIA1300VE3·2S和pCAMBIA1300VE4·2S。測序分析顯示3個基因的完整表達(dá)單元成功構(gòu)建在植物表達(dá)載體pCAMBIA1300中。 3、為了更高效地改良花生中維生素E的合成效率，在單價載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個雙價植物表達(dá)載體pCAM

5、BIA1300 VE2·VE3，它含有VE2和VE3各自的啟動子和終止子表達(dá)單元。為了同時改良花生中維生素E含量和油酸含量，亦構(gòu)建得到雙價植物表達(dá)載體pCAMBIA1300AT，它含有VE4的完整表達(dá)單元和FAD2的反義RNA表達(dá)單元。 4、將pCAMBIA1300VE4-2S、pCCAMBIA1300AT、pCAMBIA13002a等3個植物表達(dá)載體通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)對花生進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，提取抗性苗DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)顯示，他們

6、的表達(dá)單元都已經(jīng)插入到花生基因組中，各得到轉(zhuǎn)基因苗3株、3株和6株，轉(zhuǎn)化率分別為：2.00％、2.00％和3.85％。由于這些基因都是由種子特異表達(dá)啟動子所引導(dǎo)，應(yīng)待轉(zhuǎn)基因苗種子收獲后再作進(jìn)一步檢測。 綜上所述，本研究構(gòu)建了5個植物種子特異表達(dá)載體用來提高花生得維生素E含量，并將pCAMBIA1300VE4-2S、pCAMBIA1300AT、pCAMBIA13002a等3個載體對花生進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，得到了轉(zhuǎn)基因植株，為改良花生維生素