腎上腺髓質(zhì)素在卵巢癌中的表達及其對ERK活性的影響.pdf

1、卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮體癌而居第三位，但死亡率卻居各類婦科腫瘤的首位。其特點是發(fā)現(xiàn)晚，進展快，治療效果不理想，死亡率高，由于缺乏有效的早期診斷和治療方法，發(fā)現(xiàn)時多屬晚期，手術(shù)及化療效果不佳。卵巢癌的發(fā)病機制十分復(fù)雜，現(xiàn)代分子生物學(xué)研究表明：惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅與腫瘤細胞的異常增殖、分化及細胞凋亡抑制有關(guān)，而且與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制異常有關(guān)。腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，AM)是Kita

2、mura等首次從人的腎上腺嗜鉻細胞瘤中發(fā)現(xiàn)并分離出來的一種多功能肽類物質(zhì)，由于在腎上腺髓質(zhì)中的表達最高，所以被稱為AM?，F(xiàn)已知，AM主要由血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞合成分泌，隨著對AM分子結(jié)構(gòu)、生理作用以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)AM在人類腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移機制中也發(fā)揮重要的作用?，F(xiàn)已知，有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是AM的重要傳導(dǎo)通路之一，是細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，ERK與

3、惡性腫瘤預(yù)后密切相關(guān)。 本實驗采用RT-PCR、MTT比色法及免疫印跡法檢測卵巢上皮性惡性腫瘤，卵巢良性腫瘤及正常卵巢組織中，AM的表達情況及AM、AM受體阻斷劑(AM22-52)對卵巢癌細胞增殖及ERK活性的影響，探討AM在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為卵巢癌的生物治療提供新的實驗依據(jù)。 材料與方法： 一、臨床資料 本實驗標(biāo)本取自2005年05月至2008年07月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

4、住院行手術(shù)治療，術(shù)前未行化療和放療，術(shù)后均經(jīng)病理檢查確診的病例。組織學(xué)分類包括：正常卵巢組織10例(均來自年齡45-50歲，未絕經(jīng)、患子宮肌瘤行預(yù)防性卵巢切除的患者)、卵巢上皮性良性腫瘤10例(漿液性囊腺瘤4例、粘液性囊腺瘤6例)、卵巢上皮性惡性腫瘤30例(漿液性囊腺癌21例、粘液性囊腺癌9例)，共50例。卵巢上皮性惡性腫瘤病例分期標(biāo)準(zhǔn)參照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FederationInternational of Gynecology and

5、 Obstetrics，F(xiàn)IGO)1986年手術(shù)病理分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期10例、Ⅱ期10例、Ⅲ期10例。組織學(xué)分級，高分化(G1)17例，中分化(G2)5例，低分化(G3)8例。 二、實驗方法 通過RT-PCR方法檢測卵巢上皮性惡性腫瘤、卵巢上皮性良性腫瘤及正常卵巢組織中AM的表達量；體外培養(yǎng)卵巢癌CAV03細胞株，加入不同濃度的AM及AM受體阻斷劑(AM22-52)，作用一定時間后MTT比色法檢測細胞增殖情況；收集細胞，免疫

6、印跡法檢測ERK蛋白活性的變化。 三、統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行獨立樣本t檢驗及相關(guān)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： (一)AM在卵巢上皮性惡性腫瘤、卵巢上皮性良性腫瘤及正常卵巢組織中的表達。 RT-PCR實驗結(jié)果顯示：AM在卵巢上皮性惡性腫瘤、卵巢上皮性良性腫瘤及正常卵巢組織中均有表達。在正常卵巢組織、卵巢上皮性良性腫瘤中呈低表達，在卵巢

7、上皮性惡性腫瘤中呈高表達。其表達量與術(shù)后病理分級相關(guān)(P<0.05)，與手術(shù)病理分期無關(guān)。從而從基因表達水平驗證了AM在上皮性卵巢癌中的表達情況。 (二)不同濃度的AM及AM受體阻斷劑(AM22-52)在卵巢癌CAV03細胞株中作用不同時間，檢測CAV03細胞增殖情況。 MTT比色法結(jié)果顯示：AM促進卵巢癌CAV03細胞株的增殖，AM四種不同濃度均表現(xiàn)為促進腫瘤增殖的作用，并且有明顯的劑量依賴關(guān)系，隨著作用時間的延長這

8、種促進作用也隨之增強，存在時間依賴關(guān)系，因此可以看出AM是CAOV3細胞增殖的促進劑。其兩者之間存在劑量-時間依賴關(guān)系；同時實驗中還觀察到：AM受體阻斷劑(AM22-52)抑制作用也存在劑量-時間的依賴關(guān)系，其作用與AM相反。從而從細胞水平驗證AM在上皮性卵巢惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。 (三)在加入不同濃度AM及AM受體阻斷劑(AM22-52)的卵巢癌細胞株CAV03中，檢測ERK活性的變化。 免疫印跡法結(jié)果顯示：AM

9、可使ERK1/2活性升高。4種不同濃度的AM激動劑及AM受體阻斷劑(AM22-52)(1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L)分別加入卵巢癌細胞株CAOV3中，用磷酸化的ERK1/2抗體檢測ERK活性的變化。隨著AM作用濃度的增加，磷酸化的ERK1/2的表達隨之增高，反映ERK1/2活性隨之升高；反之，隨著AM受體阻斷劑(AM22-52)濃度的增加，磷酸化的ERK1/2的表達隨之降

10、低，反映ERK1/2活性隨之降低，兩者之間存在著明顯的劑量依賴關(guān)系，兩者之間有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論： 1、AM在卵巢上皮性惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達，與術(shù)后病理分級密切相關(guān)。 2、AM能顯著促進卵巢癌CAOV3細胞的增殖，AM受體阻斷劑(AM22-52)則明顯抑制卵巢癌CAOV3細胞的增殖，其兩者之間存在著量效-時效的依賴關(guān)系。 3、AM能顯著促進ERK活性，AM受體阻斷劑(AM22-52)則