松墨天牛腸道細菌多樣性和粘質(zhì)沙雷氏菌木質(zhì)素降解特性的研究.pdf

1、松墨天牛（Monochamus alternatus Hope）是松樹的重大害蟲，除能直接鉆蛀危害造成松樹衰弱甚至死亡外，還是松材線蟲病的主要傳播媒介。木質(zhì)纖維素是木食性昆蟲的主要營養(yǎng)來源，包含細菌在內(nèi)的腸道微生物在幫助昆蟲降解吸收木質(zhì)纖維素中有著重要作用。本研究利用形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和分子生物學(xué)測定等方法，研究了松墨天牛幼蟲、蛹和成蟲3個發(fā)育階段腸道細菌的多樣性，篩選出具有木質(zhì)素降解功能的腸道細菌，探討了粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia m

2、arcescens）的木質(zhì)素降解功能，以期為深入理解松墨天牛的營養(yǎng)利用特性及其與寄主的協(xié)同關(guān)系提供基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用Illumina MiSeq技術(shù)對松墨天牛腸道細菌16S rDNA-V4變異區(qū)序列進行擴增、測序，發(fā)現(xiàn)腸道細菌群落共有24個菌屬，幼蟲、蛹和成蟲腸道分別有13、10和17個菌屬，分別隸屬于擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、脫鐵桿菌門、疣微菌門、藍藻門和浮霉菌門。松墨天牛腸道優(yōu)勢細菌種類及其相

3、對豐度在不同發(fā)育階段具有差異，幼蟲、蛹和成蟲的優(yōu)勢菌屬（豐度）分別是伊麗莎白菌屬（61.12％）、金黃桿菌屬（61.38%）和沙雷氏菌屬（43.92%）。顫桿菌屬、Ruminiclostridium和螺桿菌屬為幼蟲特有菌屬，土地桿菌屬、根瘤菌屬、貪噬菌屬和鞘氨醇盒菌屬為蛹特有菌屬，土壤桿菌屬、腸球菌屬、Nubsella、Blautia和短波單胞菌屬為成蟲特有菌屬。Serratia在幼蟲（12.6%）、蛹（0.85%）與成蟲（43.92%

4、）3個發(fā)育階段均有分布。松墨天牛成蟲細菌群落多樣性最高，然后依次是幼蟲和蛹。⑵以濾紙為唯一碳源進行液體培養(yǎng)，經(jīng)分離、純化和分子鑒定，從松墨天牛3個不同發(fā)育階段的腸道中篩選出20株具有木質(zhì)素降解功能的細菌，隸屬于變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門的15個菌屬，包括沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、叢毛單胞菌屬、克雷伯氏菌屬、節(jié)桿菌屬、金黃桿菌屬、根瘤菌屬、腸桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、蒼白桿菌屬、土壤球菌屬、鏈霉菌屬、無色桿菌屬和泛菌屬。

5、進一步利用羧甲基纖維素鈉（CMC）剛果紅染色法和濾紙降解實驗復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)1株可高效降解木質(zhì)素優(yōu)勢細菌—粘質(zhì)沙雷氏菌。⑶以粘質(zhì)沙雷氏菌為對象，通過硫酸鹽木質(zhì)素培養(yǎng)基液體培養(yǎng)并測定該菌株的木質(zhì)素降解性能，發(fā)現(xiàn)在第4天其降解率達到峰值（15.16%），該菌能同時產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）、錳過氧化物酶（MnP）、漆酶（Lac）3種胞外木質(zhì)素降解酶。以其中的優(yōu)勢木質(zhì)素降解酶—LiP木質(zhì)素過氧化物酶為研究對象，采用控制變量的單因素試驗法，探究體

6、外不同培養(yǎng)條件對源于松墨天牛腸道粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶活性的影響。結(jié)果表明：木質(zhì)素濃度、pH值、氮源種類、氮源濃度和金屬離子及其濃度均對其產(chǎn)酶以及酶活性有顯著影響。木質(zhì)素濃度為3 g·L-1時酶活性最強，pH值為5時最適于產(chǎn)酶，有機氮源更有利于產(chǎn)酶，且酵母膏為最佳氮源，其最適濃度為5 g·L-1；最佳Mg2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、K+離子濃度分別為0.20 g·L-1，0.40 g·L-1，0.15 g·L-1，0.0