桃芽自然休眠相關(guān)基因IRE1、bZIP60的克隆與功能鑒定.pdf

1、對落葉果樹而言，芽休眠是其為抵御冬季低溫產(chǎn)生的一種生物適應(yīng)性。隨著設(shè)施果樹的發(fā)展，芽休眠特性已經(jīng)成為果樹生產(chǎn)重要的限制因子之一。休眠期直接決定著生產(chǎn)中扣棚升溫的時間，從而關(guān)系著果品上市時間和生產(chǎn)效益。因此研究設(shè)施果樹休眠進(jìn)程進(jìn)而進(jìn)行果樹的熟期調(diào)控，具有重要的現(xiàn)實意義。
　　本研究以5年生常用油桃栽培品種‘曙光’(Prunus persica(L.) Batsch cv.NectarinaShuguang)為材料，通過透射電鏡觀察花

2、芽生長點細(xì)胞在自然休眠進(jìn)程中超微結(jié)構(gòu)變化。利用熒光定量分析了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路關(guān)鍵基因在休眠進(jìn)程中的變化規(guī)律，推測這些關(guān)鍵基因與芽自然休眠的關(guān)系。同時，對種子層積休眠解除過程中生長點細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)變化進(jìn)行檢測，探討種子休眠和芽自然休眠的關(guān)系。選用高需冷量品種‘超紅’(Prunuspersica(L.) Batsch cv.Nectarina Super Crimson，需冷量為800C.U.）和低需冷量品種‘

3、五月陽光’(Prunus persica(L.) Batsch cv.Nectarina MayGIo，需冷量為200C.U.），檢測需冷量對PpIRE1、PpbZIP60表達(dá)的影響的影響。最后構(gòu)建Pp IRE1、PpbZIP60基因的擬南芥超表達(dá)和突變體互補(bǔ)株系，驗證桃Pp IRE1、PpbZIP60基因?qū)M南芥種子萌發(fā)的影響，推測其在桃自然休眠中的功能。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1、桃樹花芽自然休眠和種子休眠過程中超

4、微結(jié)構(gòu)的變化存在一致性。主要表現(xiàn)在，在休眠期間，細(xì)胞質(zhì)由稀變濃;細(xì)胞核體積逐漸增大，核仁逐漸松散;細(xì)胞膜、核膜、質(zhì)膜等膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)由不完整變得完整，界限由模糊變得清晰;胞間連絲由少、細(xì)變多、粗，在種子休眠解除后甚至出現(xiàn)胞間通道，細(xì)胞間通過胞間連絲進(jìn)行的物質(zhì)交流日益頻繁。線粒體大量增殖，個體增大，同時內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)也逐漸變得清晰，為發(fā)芽后的迅速生長和分化作準(zhǔn)備。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的面積和數(shù)量都大大增加，休眠后期在大液泡周圍、質(zhì)膜邊緣及核膜附近都有規(guī)則排列的

5、短小的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，形成了物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的通道;高爾基體數(shù)量由少變多，囊狀片層的結(jié)構(gòu)越來越清晰完整;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體是蛋白質(zhì)的合成及加工成熟的場所，它們的增加反映了細(xì)胞中代謝酶等蛋白質(zhì)類合成活動的增加。休眠前期質(zhì)體、質(zhì)體中的淀粉粒、脂肪滴數(shù)量眾多，隨著休眠的解除，逐漸變得越來越少。
　　2、在芽自然休眠和種子自然休眠前期，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志因子BiP(BiP1和BiP2)均發(fā)生積累，可見在這個過程中發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在自然休眠進(jìn)程中IRE1-b

6、ZIP60，bZIP28-NF-Y兩條信號通路的關(guān)鍵基因PpIRE1a、PpIRE1b、PpbZIP60、PpbZIP28、Pp NF-YA4、Pp NF-YB3和PpNF-YC2轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢基本都是先升后降，與休眠進(jìn)程密切相關(guān)，可能參與休眠的調(diào)控。在桃樹沒有遺傳轉(zhuǎn)化體系的情況下，可以通過異位表達(dá)擬南芥觀察其種子萌發(fā)接推測基因的功能。
　　3、‘超紅’和‘五月陽光’自然休眠過程中，Pp IRE1、PpbZIP60基因在mRN

7、A水平表達(dá)差異不顯著。
　　4、通過將PpIRE1、PpbZIP60基因在擬南芥野生型中超表達(dá)，在播種后4d、8d、12d分別觀察統(tǒng)計超表達(dá)株系的種子萌發(fā)率，結(jié)果表明，二者超表達(dá)基因的擬南芥株系的種子萌發(fā)率雖然與野生型差異不顯著，但是萌發(fā)時間有了明顯提前，在4d時均能全部萌發(fā)，比野生型的8d縮短一半時間。
　　5、對T-DNA插入突變體株系純合株系Sail_283B03(bzip60-1)、Salk_050203(bzip6

8、0-2)、Salk_018112(ire1-1)和Sail_1256F04(ire1-2)種子萌發(fā)率試驗發(fā)現(xiàn)，bzip60-1、ire1-1在播種后12d的種子萌發(fā)率均能達(dá)到98％作用，與野生型100％的萌發(fā)率相比差異不顯著。而bzip60-2、ire1-2在播種后12d的種子萌發(fā)率僅為20％和15％，顯著低于野生型。選取bzip60-2、ire1-2突變體構(gòu)建Pp IRE1、PpbZIP60基因的突變體功能互補(bǔ)株系，對T3代種子萌發(fā)率

9、進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體互補(bǔ)株系萌發(fā)率比突變體株系顯著提高，其中35S∷PpIRE1/ire1萌發(fā)率比ire1突變體提高三倍多，互補(bǔ)株系表型部分恢復(fù);35S∷PpIRE1/ire1萌發(fā)率也較bzip60突變體提高兩倍左右。PPIRE1、PpbZIP60高表達(dá)能夠縮短擬南芥種子休眠，從而推測PPIRE1和PpbZIP60基因表達(dá)利于打破桃休眠。
　　通過該研究，初步明確了部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路關(guān)鍵基因參與休眠進(jìn)程的調(diào)控，在細(xì)胞