神經(jīng)橋接導(dǎo)管內(nèi)GDNF緩釋微囊對大鼠面神經(jīng)的誘向再生作用.pdf

1、面神經(jīng)是周圍神經(jīng)中重要的一支，支配人的面部表情，在外傷、手術(shù)、炎癥或腫瘤等情況下較易受到損傷，損傷后雖然可通過外科手術(shù)將其修復(fù)，但面部運動功能卻常常難以完全恢復(fù)正常，術(shù)后容易產(chǎn)生聯(lián)帶運動、半面痙攣等面癱后遺癥，直接或間接地影響了患者的生活質(zhì)量。
　　 體外研究表明各種外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子能誘導(dǎo)再生軸突的生長方向，并證實神經(jīng)元軸突生長方向趨向于高濃度梯度的神經(jīng)營養(yǎng)因子方向。膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)是目前所發(fā)現(xiàn)的對運動神經(jīng)

2、作用最強的神經(jīng)營養(yǎng)因子。研究中發(fā)現(xiàn)面神經(jīng)軸突的錯向再生與膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子濃度呈濃度依賴性關(guān)系，一定濃度的GDNF對周圍神經(jīng)有明顯的減少錯向再生的作用。
　　 在面神經(jīng)損傷后修復(fù)過程中，人工生物導(dǎo)管因其供體來源廣泛、無免疫反應(yīng)、減少周圍組織疤痕侵入、生長導(dǎo)向性好、隨意塑形、可以添加多種活性物質(zhì)等受到越來越多的重視。其修復(fù)的神經(jīng)缺損距離長，效果接近自體神經(jīng)移植。但如何將外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子導(dǎo)入神經(jīng)導(dǎo)管，以更有效的時間和空間特異

3、性方式釋放活性分子，一直是生物學(xué)家和工程專家共同努力的方向。
　　 本研究通過將神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF微囊化，建立不同濃度的神經(jīng)營養(yǎng)因子誘向作用評估體系，并將GDNF通過微囊的形式在神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)緩釋，嘗試在時間和空間上尋找一種更有效的神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放方式，評估其對面神經(jīng)錯向再生的修復(fù)效果。本研究共分為三個部分。
　　 第一部分，GDNF緩釋微囊的制備及其特性的測定
　　 目的：制備目的GDNF緩釋微囊并對其特性進行測

4、定。方法：復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備GDNF緩釋微囊，采用60Co放射源對凍干微囊進行輻照滅菌。通過細菌學(xué)檢查評價微囊滅菌效果，光鏡、電鏡對微囊的形態(tài)和分布進行評估，計算微囊的各物理性狀，GDNF-ELISA測定其體外釋放，細胞培養(yǎng)評估其生物學(xué)活性。結(jié)果：制備并輻射滅菌后的微囊，培養(yǎng)7天無微生物生長，滅菌微囊符合無菌規(guī)定。掃描電鏡下見微囊形態(tài)完整，表面光滑。測得微囊粒徑大小為19.15±0.23um。GDNF緩釋微囊的產(chǎn)率為79.10％，微囊的

5、載藥量為0.175ug/mg，包裹率為69.6％。體外釋放實驗示GDNF緩釋微囊前3天釋放藥物總量的1/3，3天后藥物的釋放趨于穩(wěn)定，40天內(nèi)絕大多數(shù)藥物從微囊相對穩(wěn)定的釋放出來。微囊內(nèi)GDNF生物學(xué)活性的測定結(jié)果示陽性對照組中運動神經(jīng)元突起的數(shù)量及長度與GDNF微囊組無明顯差別(P>0.05)，均優(yōu)于空白對照組中運動神經(jīng)元突起的數(shù)量及長度，證明了制備的GDNF緩釋微囊中的GDNF具有生物活性。結(jié)論：采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法成功制備GDNF緩

6、釋微囊，并采用60Co放射源對凍干微囊進行輻照滅菌。通過對微囊特性的研究、無菌檢查和GDNF活性測定證明微囊形態(tài)良好，含有目標濃度和活性的GDNF，控釋效果理想。
　　 第二部分，GDNF緩釋微囊體外釋放對運動神經(jīng)元誘向生長作用的研究
　　 目的：建立神經(jīng)細胞誘向再生模型，通過誘向再生模型對所制作的GDNF緩釋微囊進行濃度篩選，以期得到對運動神經(jīng)元誘向作用最佳的GDNF緩釋微囊濃度。方法：參考Cao等人方案研究建立神經(jīng)細

7、胞誘向生長模型，用細胞培養(yǎng)法鑒定小室中神經(jīng)細胞活性，GDNF-ELISA檢測不同分區(qū)瓊脂糖內(nèi)GDNF濃度，以證實誘向小室內(nèi)濃度梯度的形成；將不同濃度的微囊置于誘向小室中，來檢測不同濃度GDNFX寸神經(jīng)細胞的誘向作用。結(jié)果：在誘向小室內(nèi)形成濃度梯度，成功建立神經(jīng)細胞誘向生長模型，誘向小室瓊脂糖無明顯細胞毒性，該模型用于神經(jīng)細胞可行。在不同濃度微囊誘導(dǎo)運動神經(jīng)元生長方面，GDNF200ng/ml組與GDNF100ng/ml組間無明顯區(qū)別，差

8、異無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；GDNF200ng/ml組及GDNF100ng/ml組與空白對照組及GDNF50ng/ml組間比較，前兩組均明顯優(yōu)于后兩組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；空白對照組與GDNF50ng/ml組間差異明顯，也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：本部分通過建立運動神經(jīng)元誘向再生模型和利用該模型對所制作的GDNF緩釋微囊進行濃度篩選，初步確立了GDNF的體外對運動神經(jīng)元細胞誘向作用的最佳濃度為100ng

9、/ml。
　　 第三部分，神經(jīng)橋接導(dǎo)管內(nèi)GDNF緩釋微囊對大鼠面神經(jīng)誘向再生作用的研究
　　 目的：應(yīng)用含前期制備和篩選的GDNF緩釋微囊的PLGA/殼聚糖復(fù)合的神經(jīng)導(dǎo)管來橋接大鼠面神經(jīng)總干，探討面神經(jīng)損傷神經(jīng)誘向再生作用更有效的GDNF釋放方式。方法：通過解剖定位面神經(jīng)主干及各分支走行，用冰凍切片、熒光逆行追蹤法定位面神經(jīng)核在大腦中的位置及各亞核分布區(qū)域。在體研究中以實驗動物面神經(jīng)橋接室內(nèi)注射材料不同分為三組，空白對照

10、組、GDNF凝膠注射組及GDNF微囊注射組。術(shù)后9周，用面肌功能評價、組織學(xué)、錯向再生率、肌電圖指標等評價其面神經(jīng)誘向再生和面肌功能恢復(fù)情況。結(jié)果：明確面神經(jīng)主干及各分支走行，以追蹤面神經(jīng)顴支和頰支來評價面神經(jīng)錯向再生率。GDNF微囊組在收縮功能評分、熒光逆向追蹤計算錯向再生率、肌電圖等方面均優(yōu)于GDNF組及空白對照組(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：在可降解神經(jīng)生物導(dǎo)管內(nèi)加入GDNF緩釋微囊橋接被切斷的成年SD大鼠面神經(jīng)主干