特應(yīng)性皮炎皮膚屏障功能障礙與Thl-Th2型細(xì)胞因子相關(guān)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、特應(yīng)性皮炎(Atopic dermatitis,AD)是一種常見(jiàn)的慢性復(fù)發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病,近年來(lái)世界范圍內(nèi)發(fā)病率呈快速上升趨勢(shì)。AD發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,可能為遺傳背景、免疫系統(tǒng)平衡失調(diào)、皮膚屏障功能障礙以及環(huán)境因素等共同作用的結(jié)果。遺傳免疫異常及皮膚屏障功能障礙是當(dāng)前AD發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。
　　 AD免疫反應(yīng)異常主要表現(xiàn)為T(mén)h1/Th2功能的失調(diào),表現(xiàn)為高水平IgE的產(chǎn)生,肥大細(xì)胞的過(guò)度活化,以及皮膚內(nèi)樹(shù)枝狀細(xì)胞的

2、異常信號(hào)介導(dǎo)等。Th1/Th2功能失衡引起細(xì)胞因子分泌異常在AD的不同時(shí)期皮損內(nèi)表達(dá)水平有差異。急性期皮損以Th2型免疫反應(yīng)為主,白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)4、13呈優(yōu)勢(shì)表達(dá);而慢性期皮損則Th1型免疫反應(yīng)明顯增強(qiáng),干擾素(Interferon,IFN)γ呈相對(duì)優(yōu)勢(shì)表達(dá)。
　　 AD患者存在廣泛的皮膚屏障功能障礙,并與炎癥的嚴(yán)重程度呈正比。表皮屏障功能障礙主要表現(xiàn)為皮膚終生干燥,角質(zhì)層細(xì)胞(stratum cor

3、neum,SC)水合度下降,透皮水丟失(Transepidermal.water loss,TEWL)明顯增高,SC細(xì)胞間黏附性下降,過(guò)度脫屑等。屏障功能障礙可使外界抗原及病原體表皮通過(guò)性增高,進(jìn)而誘發(fā)免疫及皮膚屏障功能的進(jìn)一步損傷。
　　 絲聚合蛋白(Filaggrin,FLG)由定位于人1q21位點(diǎn)上FLG基因編碼,是正常表皮末端分化及維持皮膚水合度的關(guān)鍵蛋白,是維持表皮屏障功能完整性的重要蛋白。Profilaggrin形成

4、于顆粒層透明角質(zhì)顆粒,FL6單體依賴(lài)轉(zhuǎn)谷胺酰酶(Transglutaminases,Tgases)交連聚集角蛋白中間絲,為SC細(xì)胞角質(zhì)包膜(cornified envelope,CE)提供緊密的骨架系統(tǒng)。FLG水解后產(chǎn)生的酸性終產(chǎn)物是皮膚天然保濕因子(natural moisturizing factor,NMF)活性成分的主要來(lái)源并是維持角質(zhì)層弱酸性環(huán)境的主要因素之一。FLG功能的發(fā)揮及降解代謝過(guò)程涉及多種酶類(lèi)及離子信號(hào)。在鈣離子濃度

5、增高的情況下,profilaggrin被脫磷酸化并進(jìn)一步經(jīng)絲氨酸蛋白酶(serine protease,SP)水解。這些SPs主要包括matriptase,通道活化的絲氨酸蛋白酶1(channel-activating serine protease,CAP1),角質(zhì)層糜蛋白酶(stratum corneum chymotryptic enzyme/SCCE,又稱(chēng)kallikrein7/KLK7)及角質(zhì)層胰蛋白酶(stratum cor

6、neum tryptic enzymes/SCTE,又稱(chēng)kallikrein5/KLK5)分解profilaggrin釋放出多拷貝的功能性FLG重復(fù)肽片段單位,為CE提供骨架系統(tǒng)構(gòu)成成分。并最終在半胱氨酸基天冬氨酸特異性蛋白酶14(caspasel4)作用下產(chǎn)生具有吸濕性的降解產(chǎn)物游離氨基酸及尿刊酸(urocanic acid,UCA),吡咯烷酮羧酸(pyrrolidone carboxylic acid,PCA),構(gòu)成NMF的主要組成

7、成分。而由絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal5型基因(serineprotease inhibitor Kazal type5,SPINK5)編碼的淋巴上皮Kazal型相關(guān)抑制劑(Lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor,LEKTI)蛋白是調(diào)控這些蛋白水解酶活性最重要的抑制劑。
　　 AD皮損中FLG廣泛的低表達(dá)已被證實(shí)。盡管眾多研究表明不同人種AD患者中FLG的無(wú)功能性基因變異普遍

8、存在,是AD皮損中FLG低表達(dá)的重要原因,但這些突變僅在不足1/3患者中發(fā)現(xiàn),且具有明顯的遺傳異質(zhì)性。近年研究發(fā)現(xiàn)Th2/Th1型細(xì)胞因子也可明顯影響角質(zhì)形成細(xì)胞(Keratinocyte,KC)FLG的表達(dá),IL4,IL13可降低FLG的表達(dá),IFN-γ可提高FLG的表達(dá)。然而發(fā)生這種效應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。
　　 有證據(jù)表明AD患者TEWL的明顯增高引起機(jī)體缺水,全身的水代謝異常可進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)分泌改變。日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)在重度AD患者中

9、存在由于大量TEWL導(dǎo)致的繼發(fā)性抗利尿激素(antidiuretic hormone,ADH)增高。人體調(diào)節(jié)水代謝平衡主要是通過(guò)ADH來(lái)完成,增高的ADH作用于腎集合管主細(xì)胞,增加水的重吸收,排出較少量的高滲尿。腎臟集合管細(xì)胞上的水通道蛋2(aquaprin-2,AQP-2)是ADH作用于腎臟調(diào)節(jié)水重吸收作用的最關(guān)鍵的靶蛋白。AQP-2通過(guò)穿梭機(jī)制使得主細(xì)胞對(duì)水的重吸收大大增加。慢性限水過(guò)程中,AQP-2在腎臟表達(dá)增加。生理情況可有少量

10、AQP-2蛋白分子脫落并隨尿液排出體外,并與AQP-2在腎臟表達(dá)量呈正相關(guān)。我們于體外人KC培養(yǎng)的情況下,添加Th2,Th1型細(xì)胞因子模擬AD患者急、慢性皮損免疫異常的模式,采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR及Western Blot方法檢測(cè)KC中FLG及其代謝相關(guān)酶類(lèi)的表達(dá)變化情況,從而為揭示AD患者表皮屏障功能障礙的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù),也為將來(lái)針對(duì)AD皮損進(jìn)行屏障功能調(diào)節(jié)治療提供思路。同時(shí)通過(guò)ELISA方法檢測(cè)AD患兒尿液AQP-2(u-AQ

11、P-2)水平的變化,探討u-AQP-2水平與AD疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性,為評(píng)價(jià)兒童AD嚴(yán)重度尋找新的臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)。
　　 材料與方法：
　　 一、研究對(duì)象：
　　 1、人KC細(xì)胞:包括無(wú)血清培養(yǎng)的人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(Normal human keratinocytes,NHK)及HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞株。
　　 2、兒童AD病例組:50例AD患者均為遼寧籍漢族兒童,年齡2月-8歲。男35名,女15名。符合H

12、-R診斷標(biāo)準(zhǔn)。采用客觀特應(yīng)性皮炎評(píng)分指數(shù)(Objective Scoring AtopicDermatitis index,O-SCORAD)確定疾病的嚴(yán)重程度,于就診前3個(gè)月未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑,就診前2周未使用外用藥。
　　 3、兒童正常對(duì)照組:35例健康兒童,年齡性別與病例組相匹配。已排除有過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎及蕁麻疹、濕疹、枯草熱等特應(yīng)性疾病及家族史的遼寧籍漢族正常兒童。以上兩組研究對(duì)象均已排除其他影響水鹽

13、代謝疾病及狀態(tài),簽署知情同意書(shū)。
　　 二、實(shí)驗(yàn)材料：角質(zhì)形成細(xì)胞及培養(yǎng)液等相關(guān)試劑、實(shí)時(shí)定量RT-PCR試劑、Western Blot相關(guān)試劑、免疫組織化學(xué)及ELISA相關(guān)試劑。
　　 三、實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、人KC培養(yǎng)方法
　　 (1).NHK無(wú)血清培養(yǎng)方法:采用胰蛋白酶-EDTA,冷溫兩步消化法對(duì)人包皮皮膚組織進(jìn)行消化分離,進(jìn)而進(jìn)行NHK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng),繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn),用廣譜單克隆抗角蛋白抗體免疫組

14、織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)方法進(jìn)行鑒定。
　　 (2).HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞株培養(yǎng)方法:按常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)傳代。
　　 2、檢測(cè)人KC在Th2型細(xì)胞因子刺激下FLG及其代謝相關(guān)酶類(lèi)在不同鈣離子濃度條件培養(yǎng)下的表達(dá)。
　　 (1)、應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)KC在IL-4,IL-13刺激下FLG及其代謝相關(guān)酶類(lèi)Matriptase,CAP1,Caspase-14,SPINK5

15、/LEKTI,SCCE/KLK7,SCTE/KLK5mRNA的表達(dá)。
　　 (2)、應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)KC在IL-4,IL-13刺激下FLG及其代謝相關(guān)酶類(lèi)Matriptase,CAP1,Caspase-14,SPINK5/LEKTI,SCCE/KLK7,SCTE/KLK5蛋白水平的表達(dá)。
　　 3、檢測(cè)人KC在Th1型細(xì)胞因子刺激下FLG及其代謝相關(guān)酶類(lèi)在不同鈣離子濃度條件培養(yǎng)下的表達(dá)。
　　

16、 (1)、應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)KC在IFN-γ刺激下FLG及其代謝相關(guān)酶類(lèi)Matriptase,CAP1,Caspase-14,SPINK5/LEKTI,SCCE/KLK7,SCTE/KLK5 mRNA的表達(dá)。
　　 (2)、應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)KC細(xì)胞在IFN-γ刺激下FLG及其代謝相關(guān)酶類(lèi)Matriptase,CAP1,Caspase-14,SPINK5/LEKTI,SCCE/KLK7,SCTE/

17、KLK5蛋白的表達(dá)。
　　 4、檢測(cè)兒童特應(yīng)性皮炎患者尿液中AQP-2水平,評(píng)價(jià)其與O-SCORAD評(píng)分及血液,尿液臨床指標(biāo)的關(guān)系。
　　 (1)、收集兒童AD患者病例,采用O-SCORAD評(píng)分評(píng)估嚴(yán)重度。
　　 (2)、對(duì)患兒進(jìn)行尿液pH(urine pH,u-pH),尿液比重(urine specificgravity,u-SC)及外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(Peripheral blood eosinophil

18、count,EOS),血清總IgE水平的檢測(cè)(Serum Imunoglobul in E,s-IgE)。
　　 (3)、ELISA方法對(duì)患兒及正常兒童尿液u-AQP-2水平進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)檢測(cè)尿液肌酐水平(Creatinine,Cr)進(jìn)行校正。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析過(guò)程采用SPSS13.0軟件完成。計(jì)量資料采用-x±SD表示。Kolmogorov-Smirnov test法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性,Levene'

19、s Test檢驗(yàn)各組間方差齊性。統(tǒng)計(jì)方法主要包括One-Way ANOVA分析,Student's t-test,Kruskal-Wallis檢驗(yàn),Mann-Whitney U檢驗(yàn),Pearson's test/Spearman'srank test。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1、Th2型細(xì)胞因子對(duì)人KC細(xì)胞FLG表達(dá)代謝的影響
　　 (1)IL-4及IL-13能顯著下調(diào)KC細(xì)胞FLG、SP

20、INK5/LEKTI表達(dá)(P＜0.05);上調(diào)Matriptase,CAP1,KLK7表達(dá)(P＜0.05)。
　　 (2)增高鈣離子濃度誘導(dǎo)KC分化可顯著上調(diào)KC細(xì)胞FLG,SPINK5/LEKTI,matriptase,CAP1,KLK7及KLK5表達(dá)(P＜0.05)。
　　 2、Th1型細(xì)胞因子對(duì)人KC細(xì)胞FLG表達(dá)代謝的影響IFN-γ顯著上調(diào)KC細(xì)胞FL6、SPINK5/LEKTI,Caspase14的表達(dá)(P＜0

21、.05);顯著下調(diào)Matriptase,CAP1,KLK7表達(dá)(P＜0.05)。
　　 3、兒童AD尿液AQP-2的水平及其與O-SCORAD評(píng)分,臨床相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性嬰兒期AD患兒u-AQP-2水平明顯增高且與皮膚干燥正相關(guān)。而O-SCORAD評(píng)分,EOS,s-IgE,u-SG以及性別與兒童AD u-AQP-2水平?jīng)]有相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1、角質(zhì)形成細(xì)胞中FLG及FLG代謝相關(guān)酶類(lèi)的表達(dá),受Th2,T