二倍體馬鈴薯的組培再生體系建立及抗性相關基因的遺傳轉化.pdf

1、以二倍體馬鈴薯不同基因型的莖段外植體為材料，建立了離體再生體系和轉基因技術體系；構建StPMEI基因的過量表達載體轉化馬鈴薯二倍體感病基因型ED25，StPMEI反義基因表達載體以及StPMEI、StPI和StRLK基因的RNAi表達載體轉化二倍體抗病基因型ED13，獲得了轉基因再生植株37棵，其中15棵已經進行了PCR的初步鑒定。
　　 分別以二倍體馬鈴薯抗病基因型ED13、CE171和感病基因型ED25的莖段為外植體，在優(yōu)化

2、植物激素濃度及配比等的基礎上，對不同基因型的組培再生進行了研究和探討，結果表明：不同的基因型具有不同的激素及濃度配比要求。固體—液體培養(yǎng)基雙層看護培養(yǎng)對于二倍體馬鈴薯莖段愈傷組織的誘導是必要的，尤以固體培養(yǎng)基中NAA和6-BA的濃度配比2∶2為佳。對于ED13而言，液體培養(yǎng)基中2，4-D和KT的濃度配比2.5∶0.5為佳，相比之下對于CE171，則以1.5∶1為最好，二者的愈傷誘導率均達100％；然而對于基因型ED25，只有在NAA和6

3、-BA的濃度配比2∶1，2，4-D和KT的濃度配比1.5∶1時才能形成較好的愈傷。ZT在愈傷組織誘導不定芽分化過程中具有重要作用，單獨使用ZT，濃度為1mg/L時，ED13和CE171的芽分化率均可達95％以上；而對于ED25，則只有在ZT和6-BA配合使用，濃度配比為0.5∶2.5時才可獲得較高的芽分化率。
　　 以ED13基因組DNA為模板，利用基因特異引物進行PCR擴增，分別獲得了StPMEI、StPI和StRLK基因的完

4、整編碼區(qū)及相應的用于RNAi的基因片段，經T-A連接后，轉化受體菌獲得了DH5α陽性重組子。進一步酶切及連接后，成功地構建了StPMEI正、反義全長基因的植物表達載體pBI-PMEI和pBI-AS-PMEI及RNAi植物表達載體pCH-PMEI、pCH-PI和pCH-RLK，轉化農桿菌LBA4404后進行馬鈴薯的快速基因轉化，獲得了預期轉化子37株，其中15株已經進行了PCR檢測確定為陽性，其它的22株尚待檢測確定。
　　 影響

5、莖段外植體轉化效率的因素很多。研究表明：預培養(yǎng)2d，菌液OD600為0.5，侵染時間10min，共培養(yǎng)時間2d，可獲得較好的轉化效果。合適的抗生素篩選壓對于轉基因植株的選擇至關重要：對于抗病基因型ED13而言，卡那霉素(Km)和慶大霉素的篩選濃度均以50mg/L為佳，而對于感病基因型ED25，Km篩選濃度則以30mg/L為佳。在轉基因植株的篩選過程中，農桿菌抑菌劑特美汀(Tim)的濃度以150mg/L抑菌效果最好，不但可以完全抑制農桿菌