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文檔簡介
1、放射性腦損傷(radiation injuries,brain,RIB)及其隨之而來的放射性腦病是由于利用射線治療頭頸部的腫瘤后,造成的臨近腦組織的直接或者間接損害及其損害所產(chǎn)生的相應(yīng)并發(fā)癥?;颊哳净碱^部或者頸部的腫瘤后,至本病的中后期往往需要進(jìn)行放射治療,經(jīng)過一定的潛伏期后大多數(shù)患者會產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)的損傷,這種損傷一旦形成后損害往往很難逆轉(zhuǎn),嚴(yán)重影響著患者的健康與生存質(zhì)量。RIB發(fā)病機(jī)制目前尚無定論,目前的研究大部分集中到血管、細(xì)胞及免
2、疫反應(yīng)等諸多方面,例如血管結(jié)構(gòu)的破壞,細(xì)胞組分的變性與壞死以及自身免疫物質(zhì)的產(chǎn)生等。目前對放射性腦病的治療方法較多,臨床上以脫水降顱壓、營養(yǎng)腦神經(jīng)等治療,雖然藥物眾多,但治療效果往往一般且多缺乏明顯的對因治療。近年來,細(xì)胞因子、基因等新興方法的出現(xiàn)為RIB的治療提供了及其廣泛的前景。
Notch是一種細(xì)胞受體蛋白,它幾乎存在于大多數(shù)的細(xì)胞中,特別是增殖能力較強(qiáng)的細(xì)胞中,它在信號傳遞過程中扮演著重要的角色,相鄰細(xì)胞之間通過Not
3、ch信號通路的調(diào)控,影響著動植物的生長與發(fā)育,Notch信號通路及其保守。無論是在高等生物中還是在低等的生物中Notch信號通路都發(fā)揮著重要的作用,細(xì)胞的增生與分化,神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育完全及器官等形成都離不開Notch信號通路。多項實驗研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在Notch-Hes信號傳遞系統(tǒng),這種系統(tǒng)可以抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,維持神經(jīng)干細(xì)胞的生長與增殖。
γ-分泌酶是生物體內(nèi)一種及其重要的酶類,它在Notch信號
4、通路中處于顯著的地位,隨著人工合成技術(shù)的不斷提高,人們發(fā)現(xiàn)了一種重要的化合物—DAPT,它是一種抑制物,能夠明顯的抑制γ-分泌酶,有效地減弱這種酶的活性,特異的阻斷Notch通路的表達(dá)。DAPT的研究多集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病,已有很多研究證實DAPT能夠抑制體外細(xì)胞的增殖,且存在著明顯的劑量依賴性。HES1基因是Notch受體蛋白下游的基因之一,已有研究表明利用DAPT處理HeLa細(xì)胞后,可以檢測到HeLa細(xì)胞中Notch1的mRNA
5、表達(dá)含量減少,由于Notch1表達(dá)的減少,其下游目標(biāo)基因HES1的表達(dá)也會相應(yīng)的減少。
bFGF是一種具體作用機(jī)制尚不太明確的神經(jīng)生長因子,它在新生血管的形成、創(chuàng)傷組織的修復(fù)與愈合過程中都有舉足輕重的意義,在神經(jīng)系統(tǒng)方面,其作用主要是促進(jìn)對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活性,在周圍神經(jīng)方面促進(jìn)損傷組織的再生。目前關(guān)于bFGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用機(jī)制已研究得比較清楚,主要包含:Ras/Raf/MEK/ERK、PKC、PI3K、JAK
6、/STAT等重要途徑。
為更好地明確外源性bFGF治療RIB的作用機(jī)制,了解Notch信號通路與bFGF抗輻射作用之間的關(guān)系,以C17.2神經(jīng)干細(xì)胞(C17.2NSCs)為工具細(xì)胞,建立放射性神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells,NSCs)放射性損傷模型后,采用堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)分別與Notch信號通路的阻斷劑DAPT處理接受放射損傷后C17.2NSCs及射線處理后的細(xì)胞,觀察細(xì)胞的生長與增殖,檢測Not
7、ch信號通路下游基因即Notch1,RBP-Jκ,Hes1,Hash1基因的表達(dá),探討Notch信號通路與外源性堿性成纖維細(xì)胞生長因子之間相互作用的可能機(jī)制。不但有助于闡明繼發(fā)性放射性神經(jīng)系統(tǒng)損傷的復(fù)雜病理過程,且有希望為放射性神經(jīng)系統(tǒng)損傷尋找出新的治療靶點,從而為設(shè)計出新型的阻斷劑或特定部位的靶點信號分子的激活劑,等治療藥物等,為人類造福。
目的:
1.建立C17.2 NSC放射性損傷模型后觀察不同時期Notch1
8、,RBP-Jκ,Hes1,Hash1表達(dá)情況的差異。
2.在bFGF參與對C17.2 NSC保護(hù)的情況下,觀察不同時期上述節(jié)點分子的表達(dá)情況,并做對比分析。
3.加入γ-分泌酶抑制劑DAPT觀察C17.2 NSC放射性模型細(xì)胞不同時期的凋亡、壞死及增殖分化情況。
研究方法:
1.C17.2神經(jīng)干細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)
2.C17.2神經(jīng)干細(xì)胞Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色
3.MTT法檢測
9、細(xì)胞活性
4.放射誘導(dǎo)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞凋亡及bFGF的保護(hù)作用和DAPT等的影響
各種蛋白表達(dá)檢測:
(1)細(xì)胞免疫化學(xué)熒光染色
(2)提取細(xì)胞總蛋白并檢測含量
1.細(xì)胞總蛋白的提取
2.酶標(biāo)儀檢測蛋白含量
3.Western Blot檢測
結(jié)果:
1.正常細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞接種后于第二日上午于顯微鏡下觀察,細(xì)胞貼壁生長,大部分細(xì)胞呈三角形,不規(guī)則
10、形,或圓形,多邊形,細(xì)胞有較長的突起,相鄰細(xì)胞之間突起可以相連,細(xì)胞培養(yǎng)約2-3天后,細(xì)胞貼滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
2.對細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色,神經(jīng)干細(xì)胞中nestin蛋白抗原與抗體結(jié)合,結(jié)果顯示經(jīng)過細(xì)胞免疫組化染色后98%以上的細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)被染成棕色,蘇木素復(fù)染后細(xì)胞核呈藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)棕色。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7-8代后,免疫組化染色陽性率仍在90%以上。
3.從MTT OD結(jié)果表明,加入DAPT,神經(jīng)干細(xì)胞的生長受限,且其濃度的越高
11、,MTT OD值則越低,也即隨著DAPT濃度的升高,細(xì)胞的生長抑制程度增加,加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子后,與單純DAPT組各組間兩兩比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),即DAPT抑制細(xì)胞的生長,而堿性成纖維細(xì)胞能夠減輕這種抑制作用,且存在著明顯的劑量依賴性。
4.經(jīng)射線照射后MTT結(jié)果顯示與正常對照組(未經(jīng)射線照射)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),即射線能夠損傷神經(jīng)干細(xì)胞,抑制神經(jīng)干細(xì)胞的生長;細(xì)胞在96孔板中貼壁
12、生長后,加入不同設(shè)計濃度的DAPT后繼續(xù)培養(yǎng),一段時間后利用射線照射,MTT結(jié)果表明各組與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),加入不同濃度DAPT并經(jīng)過射線處理后的各組與僅經(jīng)過射線處理后組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。DAPT能夠協(xié)同射線共同作用與神經(jīng)干細(xì)胞,進(jìn)一步抑制神經(jīng)干細(xì)胞的生長,且隨著DAPT濃度的升高,抑制作用愈強(qiáng)。成纖維細(xì)胞生長因子+DAPT+射線組與相同濃度的DAPT+射線處理組相比,各組之間均有
13、統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05),前組的MTT結(jié)果的OD值明顯高于后者,即堿性成纖維細(xì)胞生長因子能夠?qū)笵APT及射線對神經(jīng)干細(xì)胞的損傷作用,促進(jìn)細(xì)胞的生長與增值,對神經(jīng)干細(xì)胞有保護(hù)作用。
5.利用流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)干細(xì)胞的生長于增殖,結(jié)果顯示,與未經(jīng)任何處理的組相比,照射組細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞死亡率均明顯高于正常對照組。各組細(xì)胞貼壁生長后加入不同濃度的DAPT,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后再利用射線進(jìn)行處理,流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,隨著DA
14、PT濃度的升高,細(xì)胞的凋亡率及死亡率明顯增加,各組間兩兩比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。不同DAPT組與單純照射組相比,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。成纖維細(xì)胞生長因子+DAPT+射線組與相同濃度的DAPT+射線處理組相比,各組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05),前組的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞死亡率明顯低于后者。
6.細(xì)胞經(jīng)過免疫熒光染色后結(jié)果顯示,神經(jīng)干細(xì)胞中存在Hes1及RBP-Jκ蛋白。細(xì)胞胞質(zhì)在電子顯微鏡現(xiàn)觀察呈
15、現(xiàn)亮綠色。
7.Western結(jié)果顯示照射處理后的神經(jīng)干細(xì)胞隨bFGF濃度的升高RBP-Jκ蛋白的表達(dá)逐漸降低,而Hes1蛋白含量則逐漸升高;照射處理后的神經(jīng)干細(xì)胞隨DAPT濃度的升高RBP-Jκ蛋白的表達(dá)逐漸升高,而Hes1蛋白含量則逐漸降低;成纖維細(xì)胞生長因子+DAPT+射線組與相同濃度的DAPT+射線處理組相比,RBP-Jκ蛋白的表達(dá)降低,而Hes1蛋白含量則逐漸升高。
結(jié)論:
1.DAPT能夠抑制C
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