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文檔簡介
1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育涉及包括神經(jīng)誘導(dǎo)、細(xì)胞周期的調(diào)控、神經(jīng)元特異基因的表達(dá)和神經(jīng)前體細(xì)胞的分化等多個過程,而這些過程又涉及了居多信號通路以及相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物的相互作用。總的趨勢是:先由少數(shù)幾個基因產(chǎn)物發(fā)揮作用,使部分信號通路活化,活化的信號通路又導(dǎo)致更多的基因轉(zhuǎn)錄,活化更多的信號通路;逐漸使不同的細(xì)胞出現(xiàn)基因表達(dá)差異,進而出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的差異,最后細(xì)胞建立相對穩(wěn)定的、可傳遞的、與結(jié)構(gòu)和功能相適應(yīng)的基因表達(dá)模式。為了解腦發(fā)育和腦損失修復(fù)過程
2、中相關(guān)基因的表達(dá)變化,我室利用基因芯片技術(shù)對小鼠腦發(fā)育過程中基因進行篩選,獲得了1037條腦發(fā)育相關(guān)基因,Dbnl是在此研究中獲得的與軸突生長相關(guān)的7個基因之一。 Dbnl是新發(fā)現(xiàn)的小鼠drebrin基因成員,Shrao T研究證實Dbnl基因位于13<'#>染色體中間位置,由660個氨基酸組成,翻譯后為120Kb大小蛋白,特異性表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng),初步研究表明其可能參與調(diào)節(jié)樹突棘的形成以及神經(jīng)元的遷移。Drebrin是一種與腦發(fā)育
3、密切相關(guān)的蛋白,其特異性表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng),后來的研究顯示在非神經(jīng)元內(nèi)也存在有drebrin的亞類表達(dá)。目前在哺乳動物發(fā)現(xiàn)drebrin有四種亞類,他們都是單一基因通過不同的mRNA剪接方式形成。生物信息學(xué)分析表明,drebrin有且只有一個特異的區(qū)域與actin進行結(jié)合,這個區(qū)域位于drebrin的中心,去除這個結(jié)合位點,drebrin就不能與F-actin結(jié)合。drebrin通過與actin結(jié)合調(diào)節(jié)actin細(xì)胞骨架在細(xì)胞內(nèi)的聚合和解聚
4、過程,進而引起細(xì)胞形態(tài)改變,對細(xì)胞分化遷移以及神經(jīng)元突起的形成起重要的調(diào)節(jié)作用。 樹突形成被認(rèn)為是成熟神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)可塑性最顯著的特性,也是NSCs分化和遷移的重要特征和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。NSCs在分化和遷移過程中,一個最主要的形態(tài)學(xué)特征改變便是突起的形成和延長,分化成熟的神經(jīng)細(xì)胞在到達(dá)遷移終點后,與其周邊的細(xì)胞通過樹突棘建立突觸(synapse)連接。樹突棘是神經(jīng)元樹突的微小棘狀突起,在腦內(nèi)也是多數(shù)突觸的突觸后成分,其最基本的細(xì)胞骨架
5、結(jié)構(gòu)是F-actin。在樹突棘內(nèi),多種actin的連接蛋白和調(diào)節(jié)蛋白伴隨著軸突的生長和樹突的形成而呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式,他們在調(diào)節(jié)軸突和樹突的形態(tài)學(xué)改變中發(fā)揮了重要的作用。因此,對細(xì)胞骨架蛋白以及相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的深入研究可能為解釋NSCs分化、遷移等機制問題提供新的理論思路。 基于Dbnl對神經(jīng)元發(fā)育調(diào)節(jié)和突觸可塑性的調(diào)節(jié)作用,我們推測Dbnl影響NSCs分化和遷移,對NSCs分化后突觸連接的建立也具有促進作用,因此,本課題在了解D
6、bnl在小鼠腦發(fā)育和神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中表達(dá)模式和定位的基礎(chǔ)上,進一步探索Dbnl對小鼠NSC體外分化的可能影響,以及分化遷移后NSC在形成突觸連接過程中的作用和可能的機制。研究結(jié)果簡要如下: (1)以western blot和免疫組化等方法,了解Dbnl在小鼠腦發(fā)育過程中的表達(dá)模式和定位,結(jié)果顯示,在小鼠腦發(fā)育的不同階段,均有Dbnl蛋白的表達(dá),其中在胚胎后期,Dbnl的表達(dá)達(dá)到高峰,隨后下降,出生以后表達(dá)再次上調(diào),在出生7d
7、時最高,隨后又下降,成年以后Dbnl呈低水平表達(dá)表達(dá);在腦內(nèi):Dbnl主要表達(dá)在海馬,室管膜,皮層等神經(jīng)元和神經(jīng)干細(xì)胞分布密集的區(qū)域;而Dbnl在細(xì)胞內(nèi)的定位也有一定的時空模式,表現(xiàn)在胚胎時,Dbnl彌散分布在細(xì)胞的周邊,而出生以后Dbnl主要分布在細(xì)胞的突起。這些結(jié)果提示Dbnl不但在腦發(fā)育發(fā)育過程中調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)生以及突觸的形成,而且可能對神經(jīng)干細(xì)胞的分化和遷移也具有一定影響。 (2)以western blot,real-t
8、ime PCR等方法,了解在NSCs分化過程中,Dbnl的表達(dá)變化模式,結(jié)果顯示,在NSCs分化過程中,Dbnl有不同程度的表達(dá),其mRNA和蛋白表達(dá)的高峰在細(xì)胞分化的第3d時,在細(xì)胞內(nèi),Dbnl主要分布在細(xì)胞的突起;免疫熒光雙標(biāo)顯示,Dbnl與細(xì)胞內(nèi)的actin蛋白有明顯在共聚現(xiàn)象。這些結(jié)果提示:Dbnl可能調(diào)節(jié)NSCs的分化,對神經(jīng)干細(xì)胞突起的形成具有一定的促進作用。 (3)從出生1d的小鼠腦內(nèi)擴增出Dbnl的全長基因,進而
9、構(gòu)建了EGFP-Dbnl真核表達(dá)載體,以電轉(zhuǎn)法將構(gòu)建的載體成功導(dǎo)入體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞,在無其他因子作用下,過表達(dá)Dbnl的神經(jīng)干細(xì)胞能正常分化,通過免疫熒光染色,了解過表達(dá)Dbnl后,神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)actin、突觸后致密蛋白PSD-95和突觸蛋白Synapsinl的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染Dbnl以后,actin和synapsinl的表達(dá)無明顯影響,而PDS-95表達(dá)水平增加,但PSD-95與Dbnl表達(dá)并不完全的共聚。結(jié)果提示在NSC
10、s分化過程中,Dbnl與其結(jié)合的細(xì)胞骨架蛋白actin之間并無表達(dá)依賴關(guān)系,但能夠調(diào)節(jié)突觸相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平,因此我們推測,Dbnl可能通過影響actin在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)形式,進而影響突觸相關(guān)蛋白在樹突的表達(dá)水平。 (4)根據(jù)Dbnl的基因結(jié)構(gòu)特點,我們設(shè)計和構(gòu)建了Dbnl mRNA干擾載體,以病毒包裝的方式干擾體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞。觀察了在沉默細(xì)胞內(nèi)源性Dbnl以后,細(xì)胞的分化狀態(tài)和相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾Db
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