甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因功能的研究.pdf

1、甜菜M14品系是在栽培甜菜（Beta vulgaris L.）染色體組上附加有野生白花甜菜（B.corolliflora Zoss.）第9號(hào)染色體的甜菜單體附加系。經(jīng)鑒定甜菜M14品系具有野生白花甜菜（B.corolliflora Zoss.）的一些優(yōu)良性狀，如耐鹽性以及無融合生殖等，推測(cè)能夠使甜菜M14品系獲得野生種的一些優(yōu)良基因性狀很可能是由于白花甜菜的第9號(hào)染色體的導(dǎo)入，因此甜菜M14品系是挖掘和利用甜菜優(yōu)質(zhì)基因的良好材料。硫氧還

2、蛋白過氧化物酶(Thioredoxin peroxidase，Tpx)，是過氧化物酶(Peroxiredoxin，Prx)家族的一員。近年來，研究發(fā)現(xiàn)植物硫氧還蛋白過氧化物酶基因廣泛參與植物非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，暗示硫氧還蛋白過氧化物酶在改良作物與研究植物的抗逆性問題上顯示出其潛在的優(yōu)越性。
　　本研究基于課題組的前期工作基礎(chǔ)，利用RACE技術(shù)獲得甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶基因(BvM14-Tpx) cDNA全長(zhǎng)，共計(jì)10

3、44 bp，包含最大的ORF為489 bp，編碼162 aa;序列分析顯示，該氨基酸序列含有一個(gè)過氧化的半胱氨酸殘基和一個(gè)還原態(tài)的半管氨酸殘基;該基因所編碼的蛋白質(zhì)含有三個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，一個(gè)酰基化位點(diǎn)，四個(gè)酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn);熒光定量分析結(jié)果顯示BvM14-Tpx基因在甜菜M14品系根、莖、葉、花中廣泛表達(dá)，且根中表達(dá)量最高。構(gòu)建了BvM14-Tpx基因的大腸桿菌表達(dá)體系，結(jié)果表明BvM14-Tpx能夠在大腸桿菌中表達(dá)。以轉(zhuǎn)空

4、載體菌株為對(duì)照，對(duì)在含有H2O2脅迫處理下，測(cè)定轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因的大腸桿菌BL21(DE3)菌體的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因菌株比對(duì)照菌株提前1h進(jìn)入生長(zhǎng)期，說明BvM14-Tpx基因能夠緩解H2O2對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制。構(gòu)建BvM14-Tpx基因的釀酒酵母過表達(dá)體系，通過H2O2及NaCl脅迫轉(zhuǎn)基因釀酒酵母，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因酵母的生長(zhǎng)好于對(duì)照，說明BvM14-Tpx基因可以提高轉(zhuǎn)基因酵母的耐鹽堿能力。構(gòu)建BvM14-Tpx基因植物

5、表達(dá)載體，對(duì)擬南芥突變株tpx進(jìn)行恢復(fù)。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性恢復(fù)植株RT幼苗進(jìn)行H2O2及NaCl脅迫處理，以野生型擬南芥WT為對(duì)照，熒光定量PCR測(cè)定BvM14-Tpx基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥恢復(fù)植株中BvM14-Tpx基因的表達(dá)量高于野生型擬南芥WT中擬南芥Tpx基因的表達(dá)量。
　　本研究以野生型擬南芥WT及擬南芥突變株tpx幼苗為對(duì)照，觀察及測(cè)定擬南芥的生長(zhǎng)及根長(zhǎng)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性恢復(fù)植株RT幼苗生長(zhǎng)狀況、根

6、長(zhǎng)情況與野生型擬南芥幾乎一致，而好于擬南芥突變株tpx;氧自由基含量測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥恢復(fù)植株RT中氧自由基與野生型擬南芥WT基本一致，低于擬南芥突變株tpx;同時(shí)K+離子含量的測(cè)定結(jié)果顯示:脅迫處理前后K+離子含量沒有明顯變化;而Na+離子含量的測(cè)定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥恢復(fù)植株RT中Na+離子含量與野生型擬南芥WT基本一致均低于擬南芥突變株tpx中的Na+離子含量。以上結(jié)果表明:BvM14-Tpx基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥恢復(fù)株RT中