單增李斯特氏菌液相核酸探針檢測方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、李斯特氏菌(Listeria)在自然界分布廣泛，可來源與土壤、水、植物和反芻動(dòng)物、人的糞便，極易污染各類食品。該屬中的單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，以下簡稱單增李斯特氏菌)主要侵襲孕婦、新生兒、免疫功能低下成人，特別是老年人，更可導(dǎo)致人和動(dòng)物患腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等，病死率高達(dá)30％～70％，是目前最重要的人類食源性病原菌之一。國內(nèi)外對單增李斯特氏菌均給以高度重視，WHO將其列為21世紀(jì)對中國人

2、衛(wèi)生健康具有重大影響的12種病原微生物之一，并建立了單增李斯特氏菌食源性疾病報(bào)告系統(tǒng)。 傳統(tǒng)單增李斯特氏菌檢測方法，主要是常規(guī)增菌培養(yǎng)后在進(jìn)行生化鑒定，檢測過程耗時(shí)4～10天，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以適應(yīng)快速檢驗(yàn)的要求。免疫法比較快，但單克隆抗體制備比較困難，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性差。而PCR方法快速特異，靈敏度很高，但由于死菌中的DNA降解較慢，也容易產(chǎn)生假陽性。前增菌可以部分減少PCR檢測時(shí)出現(xiàn)的假陽性，但增加分析時(shí)間，且當(dāng)死菌含量增

3、多時(shí)，用PCR結(jié)合探針仍可以檢測到假陽性信號。因此，研究一套高效可行的檢測方法顯得十分必要。 本實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用新近發(fā)展起來的基因探針方法快速檢測食品中單增李斯特氏菌，簡化了檢驗(yàn)流程、提高檢測效率，并探討了其在禽肉類樣品檢測中的應(yīng)用。選擇單增李斯特氏菌同源性較高的致病基因hlyA，利用Primer5.0，Oligo6和Lasergene等軟件設(shè)計(jì)核酸探針，探針大小21bp，具有寡核苷酸探針的優(yōu)點(diǎn)。此方法利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)吖啶酯標(biāo)記寡核

4、苷酸探針，所設(shè)計(jì)的探針能夠與目的核苷酸片段雜交，形成DNA-RNA雜交體，雜交后無需分離步驟，利用差分水解(Differential hydrolysis)鑒別，即先加入弱堿性溶液，未經(jīng)雜交的發(fā)光探針失去發(fā)光特性(半衰期小于1min)，而與靶細(xì)胞雜交的探針可以保護(hù)吖啶酯不在堿性環(huán)境下水解。由于吖啶酯平面結(jié)構(gòu)鑲嵌于雜交體雙螺旋的內(nèi)部，受到空間位阻的保護(hù)，水解速度緩慢(半衰期10min以上)，仍有發(fā)光性能，再加入堿性H2O2進(jìn)行檢測時(shí)，能夠

5、再發(fā)光儀上檢測到發(fā)光，整個(gè)試驗(yàn)過程只需要30分鐘。此方法稱為核酸雜交保護(hù)分析，目前在我國還很少應(yīng)用。 取單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)株的純培養(yǎng)菌進(jìn)行核酸雜交保護(hù)分析的試驗(yàn)，通過條件的篩選和優(yōu)化，此方法能夠特異性的檢測出單增李斯特氏菌，而對綿羊李斯特氏菌，空腸/結(jié)腸彎曲菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、綠膿假單胞菌等非單增性李斯特氏菌均檢測為陰性結(jié)果。挑取不同個(gè)數(shù)的陽性菌落進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，最低檢測限度為2個(gè)陽性菌落(1