特發(fā)性血小板減少性紫癜免疫發(fā)病機(jī)制的臨床與基礎(chǔ)研究.pdf

1、特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）屬于自身免疫性疾病，又稱免疫性血小板減少性紫癜（autoimmune thrombocytopenic purpura ITP），其免疫機(jī)制是ITP患者體內(nèi)產(chǎn)生抗血小板膜糖蛋白的血小板相關(guān)抗體，使血小板被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)或補(bǔ)體系統(tǒng)過(guò)度破壞，而引起血小板減少，出現(xiàn)出血的臨床表現(xiàn)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)除體液免疫外，細(xì)胞免疫在ITP發(fā)病機(jī)制中的

2、作用不容忽視，其中針對(duì)血小板膜糖蛋白的抗原特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞的異常活化起著關(guān)鍵性作用，一旦這種血小板抗原特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫耐受機(jī)制被打破，可輔助同種自身抗原特異性B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體導(dǎo)致自身免疫病ITP的發(fā)生。研究證實(shí)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）及樹突狀細(xì)胞（DC）在維持機(jī)體自身免疫耐受中均發(fā)揮著及其重要的作用，CD4+CD25+ Treg細(xì)胞和／或DC的免疫缺陷均可導(dǎo)致自

3、身免疫性疾病的發(fā)生。其中CD4+CD25+Treg細(xì)胞由胸腺髓質(zhì)中的T細(xì)胞分化發(fā)育而來(lái)，通過(guò)主動(dòng)抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化、維持自身免疫耐受；而DC作為已知功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞（APC），能唯一激活初始型T細(xì)胞致敏，產(chǎn)生初次免疫應(yīng)答，成熟DC聯(lián)合抗原作用可加強(qiáng)免疫應(yīng)答，而不成熟DC又可促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制或免疫耐受，因此，DC亦被視為機(jī)體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。T細(xì)胞異?；罨筝o助B細(xì)胞活化，分泌抗體；同時(shí)活化的B細(xì)胞可作為APC直接活

4、化T細(xì)胞，因此B細(xì)胞在自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化效應(yīng)中亦發(fā)揮一定的作用。 本課題旨從臨床和基礎(chǔ)兩方面來(lái)探討CD4+CD25+Treg細(xì)胞、DC及B細(xì)胞在ITP免疫發(fā)病機(jī)制中的作用，為ITP的免疫治療開辟新的思路。通過(guò)對(duì)ITP患者外周血循環(huán)中CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量及體外免疫抑制功能的檢測(cè)，大劑量地塞米松（HD—DXM）治療前后CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量及相關(guān)抗炎細(xì)胞因子IL—10、TGF—β1的變化來(lái)闡明CD4+C

5、D25+Treg在ITP患者中的免疫異常并探討HD—DXM免疫抑制作用的機(jī)理；檢測(cè)了ITP患者外周血循環(huán)中DC細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子的表達(dá)、HD—DXM治療前后不同DC亞型數(shù)量的變化、體外CD4+T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)等來(lái)初步探討DC在ITP發(fā)病機(jī)制中的意義；針對(duì)ITP患者外周血循環(huán)中B細(xì)胞數(shù)量及其細(xì)胞協(xié)同刺激分子的表達(dá)探討其臨床意義。 1.特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）患者中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫異常 為探討

6、CD4+CD25+Treg細(xì)胞在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用，本研究運(yùn)用了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)32例ITP患者外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞、CD4+CD25highT細(xì)胞、CD4+ FOXP3+T細(xì)胞及CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞的數(shù)量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）Foxp3 mRNA的表達(dá)水平；將ITP患者CD4+CD25highT細(xì)胞與自身CD4+CD25—T細(xì)胞混合培養(yǎng)，檢測(cè)CD4+CD25high

7、T細(xì)胞的免疫抑制功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ITP患者外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞約占CD4+T細(xì)胞（15.64±5.82）%，明顯高于正常對(duì)照組（9.30±3.95）%（P<0.001），CD4+CD25highT細(xì)胞比例為（1.53±0.66）%，與對(duì)照組比較（1.36±0.55）%無(wú)顯著性差異（P>0.05）；CD4+FOXP3+T細(xì)胞和CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞分別為（1.82±1.42）%和（1.25±0.94）%，均明顯低

8、于對(duì)照組（3.90±1.37）%（P<0.001）和（2.65±0.92）%（P<0.001）。ITP患者外周血PBMC中FOXP3 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下調(diào)（P<0.001），CD4+CD25highT細(xì)胞的免疫抑制活性較對(duì)照組明顯減弱（p<0.001）。 2.慢性ITP患者大劑量地塞米松治療前后CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T的變化及與抗炎細(xì)胞因子的關(guān)系 前期研究已證實(shí)在ITP患者中存在CD4+CD25+Treg細(xì)

9、胞的免疫異常，為證實(shí)在ITP患者中CD4+CD25+ Treg細(xì)胞與抗炎細(xì)胞因子IL—10、TGF—β1是否有一定的關(guān)聯(lián)及大劑量地塞米松（HD—DXM）對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞及IL—10、TGF—β1的影響，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了26例慢性ITP患者在HD—DXM治療前后CD4+CD25+T細(xì)胞、CD4+CD25highT細(xì)胞、CD4+ FOXP3+T細(xì)胞的數(shù)量變化；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)ITP患者在HD—DX

10、M治療前后血清中IL—10及TGF—β1的濃度變化；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ITP患者HD—DXM治療前后外周血CD4+T細(xì)胞中FoXP3、IL—10、TGF—βmRNA的表達(dá)水平；免疫組化檢測(cè)DXM治療后難治性ITP患者脾臟組織中FOXP3基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，26例慢性ITP患者在確診后予HD—DXM治療，初始反應(yīng)率達(dá)92.3%。所有患者在初始治療后一周平均血小板數(shù)達(dá)（84.9±30.4）×109/L，范圍（20～150）×109/L

11、。HD—DXM治療后，慢性ITP患者外周血中CD4+FOXP3+T細(xì)胞（P<0.0001）、CD4+CD25+T細(xì)胞（P<0.0001）、CD4+CD25high T細(xì)胞（P<0.0001）數(shù)量較治療前均顯著增加。慢性ITP患者治療前血清IL—10濃度為（441.10±239.26）pg/ml，正常對(duì)照組為（349.88±21.27）pg/ml，兩者比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）；HD—DXM治療后，IL—10濃度為（395.95±1

12、49.95）pg/ml，與治療前比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）；慢性ITP患者治療前血清TGF—β濃度為（305.90±202.35）pg/ml，顯著低于正常對(duì)照組（1479.00±182.70）pg/ml，（P<0.0001）；HD—DXM治療后，TGF—β濃度較治療前明顯上升（1414.70±270.35）pg/ml，（P<0.0001）。HD—DXM治療后，慢性ITP患者外周血CD4+T細(xì)胞FOXP3+基因mRNA表達(dá)水平較治療

13、前明顯上升（P<0.05），并高于對(duì)照組（P<0.05）；IL—10基因在HD—DXM治療前后mRNA表達(dá)水平無(wú)變化，（P>0.05），與對(duì)照組比較亦均無(wú)顯著性差異（P>0.05）；治療前，TGF—β1基因mRNA表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組（P<0.05），HD—DXM治療后TGF—β1基因mRNA表達(dá)水平明顯上升（P<0.0001）；并高于對(duì)照組（P<0.05）；HD—DXM治療后，TGF—β1基因mRNA表達(dá)水平與FoXP3+基因呈

14、正相關(guān)（r=0.403，P=0.041）。蛋白Foxp3在術(shù)前應(yīng)用DXM治療的慢性難治性ITP患者脾臟組織淋巴細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯強(qiáng)于正常脾破裂對(duì)照組但弱于乙肝患者組。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在ITP免疫機(jī)制異常中，CD4+CD25+Treg及細(xì)胞因子TGF—β1發(fā)揮著一定的作用；而糖皮質(zhì)激素可通過(guò)促進(jìn)CD4+CD25+Treg及TGF—β1的表達(dá)發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。 3.慢性ITP患者中樹突狀細(xì)胞（DC）免疫異常及大劑量地塞米松治療

15、前后DC亞群數(shù)量的變化 DC被視為機(jī)體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，在維持自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用。為探討DC在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)26例慢性ITP患者在HD—DXM治療前后外周血循環(huán)中不同DC亞群數(shù)量的變化及DC表面協(xié)同刺激分子的表達(dá)；體外誘導(dǎo)分化外周血單核細(xì)胞來(lái)源的DC，觀察CD4+T細(xì)胞、DC、自體血小板或同源異基因正常人血小板混合培養(yǎng)時(shí)的CD4+T淋巴細(xì)胞增殖程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性ITP患者外周血循

16、環(huán)中pDC和mDC的絕對(duì)數(shù)量與正常對(duì)照組比較均沒(méi)有顯著性差異（P>0.05和P>0.05）；HD—DXM沖擊治療4天后，pDC絕對(duì)數(shù)較治療前減少達(dá)75.5%（P<0.0001）；而mDC絕對(duì)數(shù)較治療前雖增加了24.3%（P<0.05），但mDC上CD11c表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度（MFI）從治療前340±30降至199±21（P<0.0001）。 4.ITP患者外周血B細(xì)胞數(shù)量及表面協(xié)同刺激分子的表達(dá) 在自身免疫過(guò)程中，B細(xì)胞

17、的活化大多需要T細(xì)胞（Th）的輔助，同時(shí)B細(xì)胞特別是活化的B細(xì)胞亦可作為抗原遞呈細(xì)胞（APC）直接活化T細(xì)胞。為探討B(tài)細(xì)胞在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ITP患者外周血循環(huán)中CD19+B細(xì)胞數(shù)量、CD19+B細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子的表達(dá)及血小板相關(guān)免疫球蛋白G（PAIgG）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ITP患者包括未治療組及激素治療組與正常對(duì)照組比較，CD19+B細(xì)胞比例、CD19+CD40+/CD19+陽(yáng)性率及MFI，均無(wú)顯著性差異