Tiam1基因在肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中的功能研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC,簡稱肝癌)是常見的惡性腫瘤之一,近十年來,肝癌在我國的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。雖然隨著診療水平的不斷提高和放化療方案的不斷更新,肝癌患者的療效日益顯著,但其生存率并未顯著提高,其主要因?yàn)槭呛芏喔伟┗颊咴谛懈涡g(shù)前已出現(xiàn)了微轉(zhuǎn)移。因此,探討與肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的因素,尋找預(yù)防和治療的有效途徑,是當(dāng)代腫瘤學(xué)研究的一項(xiàng)迫切任務(wù)。
　　 T淋

2、巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(T lymphoma invasion and metastasis 1,Tiam1)基因是Db1家族的鳥嘌呤核酸轉(zhuǎn)換因子(guanine nucleotide exchange factor,GEFs)之一,GEFs主要功能是調(diào)節(jié)Rho三磷酸鳥嘌呤核苷酸水解酶(RhoGTPases)家族活性,是普遍存在的二磷酸鳥嘌呤核苷酸(GDP)與三磷酸鳥嘌呤核苷酸(GTP)轉(zhuǎn)換因子,通過參與Tiam1-Rac信號傳遞通路調(diào)

3、節(jié)細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞周期進(jìn)程、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞遷移和粘附等細(xì)胞生命活動,在腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。早期研究表明Tiam1是誘導(dǎo)人類T細(xì)胞淋巴瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的基因。
　　 Tiam1基因最初在小鼠T淋巴瘤細(xì)胞高侵襲變異株中分離鑒定。隨后,在乳腺癌、肺癌及Ras誘導(dǎo)的皮膚癌等腫瘤證實(shí)Tiam1具有明顯的促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的作用。在Tiam1敲除的動物模型中,小鼠皮膚癌發(fā)生率明顯減低并且腫瘤進(jìn)展緩慢,Malliri等認(rèn)為T

4、ima1在Ras誘導(dǎo)皮膚癌發(fā)生的啟動和進(jìn)展階段發(fā)揮關(guān)鍵作用,這一效應(yīng)與Tiam1表達(dá)量有明顯的關(guān)系。上述的研究表明,Tiam1是多種腫瘤的促癌基因和促轉(zhuǎn)移基因。
　　 本課題前期已完成如下研究工作:應(yīng)用自行設(shè)計的包括部分正常組織和常見惡性腫瘤組織的組織芯片,采用免疫組化方法檢測和觀察人體正常組織和常見惡性腫瘤組織,213例臨床隨訪資料齊全的肝癌組織和9種人肝癌細(xì)胞株及1種人正常肝細(xì)胞株中Tiam1蛋白的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)Tiam1蛋

5、白在多種腫瘤組織中高表達(dá),表明Tiam1可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子；在肝癌組織中高表達(dá),在肝硬化組織中低表達(dá),而在正常肝組織中不表達(dá),提示Tiam1可作為臨床肝癌檢測的重要腫瘤標(biāo)志物。分析Tiam1蛋白在肝癌中的表達(dá)及其與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,同時結(jié)合213例臨床隨訪資料回顧性分析Tiam1蛋白表達(dá)與肝癌患者生存期的關(guān)系,表明Tiam1與患者預(yù)后、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),提示Tiam1可作為肝癌預(yù)后判斷的重要指標(biāo),對判斷肝癌預(yù)后有重要意

6、義；為肝癌患者的診斷、預(yù)后評價、綜合治療方案設(shè)計提供有力的理論依據(jù)。
　　 在前期研究工作的基礎(chǔ)之上,本研究進(jìn)一步探討Tiam1基因?qū)Ω伟┰鲋?、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響和作用機(jī)制,擬應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)作用于同一遺傳背景、不同轉(zhuǎn)移潛能的兩種肝癌細(xì)胞株HCCLM6和MHCC97L,雙向闡明Tiam1在肝癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的主要作用,探討Tiam1作為肝癌分子靶點(diǎn)的可行性,為肝癌患者的早期診斷、預(yù)后評價和綜合治療奠定

7、理論基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 1.Tiam1基因/蛋白在人正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義
　　 用熒光定量PCR、Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞熒光、免疫細(xì)胞熒光共聚焦等方法檢測Tiam1基因/蛋白在高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株HCCLM6(簡稱M6)、低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株MHCC97L(簡稱97L)和1株正常肝細(xì)胞株HL-7702中的表達(dá),驗(yàn)證高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株中Tiam1的表達(dá)情況。

8、r>　　 2.Tiam1過表達(dá)對肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 對Tiam1/C1199HA cDNA質(zhì)粒進(jìn)行全長測序鑒定后,利用SBI慢病毒載體構(gòu)建系統(tǒng),按照SBI過表達(dá)慢病毒包裝試劑盒(System Biosciences公司)的操作說明進(jìn)行慢病毒的包裝和滴度測定。用包裝后的慢病毒過表達(dá)載體感染97L細(xì)胞,綠色熒光蛋白挑取單克隆,熒光定量PCR、Western blot及免疫細(xì)胞熒光共聚焦等鑒定轉(zhuǎn)染后Tiam1基因/蛋白在

9、細(xì)胞中的表達(dá)；利用MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測Tiam1對細(xì)胞體外增殖能力的影響；細(xì)胞劃痕和體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測Tiam1對肝癌細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的影響;裸鼠皮下瘤模型觀察Tiam1對肝癌細(xì)胞體內(nèi)腫瘤增殖能力的影響；利用裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移瘤模型觀察Tiam1對肝癌細(xì)胞癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 3.Tiam1表達(dá)沉默對肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 設(shè)計Tiam1干擾片段,構(gòu)建含U6啟動子的慢病毒載體,將慢病毒

10、載體質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT病毒包裝細(xì)胞,收集病毒上清,進(jìn)行病毒滴度測定,用慢病毒感染肝癌細(xì)胞M6,熒光定量PCR和Western blot鑒定有效的干擾載體。選取最合適的干擾片段繼續(xù)實(shí)驗(yàn),綠色熒光蛋白挑取單克隆,熒光定量PCR、Western blot及免疫細(xì)胞熒光共聚焦等鑒定干擾后Tiam1基因/蛋白在M6細(xì)胞中的表達(dá)；利用MTT法、平板克隆、流式細(xì)胞周期檢測Tiam1沉默后對M6細(xì)胞體外增殖能力的影響；細(xì)胞劃痕和體外侵襲實(shí)驗(yàn)

11、檢測Tiam1對肝癌細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的影響；裸鼠皮下瘤模型觀察Tiam1對肝癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤增殖能力的影響；利用裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移瘤模型觀察Tiam1對肝癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 4.統(tǒng)計學(xué)處理
　　 用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用重復(fù)測量方差分析對比轉(zhuǎn)染前后和干擾前后肝癌細(xì)胞株的MTT體外增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、皮下成瘤實(shí)驗(yàn)是否具有顯著性差異；采用單因素方差分析對比轉(zhuǎn)染前后和干擾前后肝癌細(xì)胞株的熒

12、光定量PCR、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲宴驗(yàn)是否具有顯著性差異；多重比較采用LSD法；P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論
　　 1.利用慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)初步研究Tiam1基因在肝癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用,發(fā)現(xiàn)Tiam1基因是肝癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的促進(jìn)基因。
　　 2.利用慢病毒介導(dǎo)的基因穩(wěn)定沉默技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證Tiam1基因在肝癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用,從反面

13、確證Tiam1基因是肝癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的促進(jìn)基因。
　　 本研究的創(chuàng)新之處
　　 1.本項(xiàng)目以慢病毒為載體,分別建立了穩(wěn)定表達(dá)外源性Tiam1基因肝癌細(xì)胞株97L/copGFP/Tiam1+和特異性Tiam1基因穩(wěn)定沉默的肝癌細(xì)胞株M6/EGFP/Tiam1-,為深入研究Tiam1基因的功能提供了有價值的工具。
　　 2.通過對比觀察表達(dá)Tiam1基因肝癌細(xì)胞株97L/copGFP/Tiam1+和特異性Tiam