銀翹散及其性味分組提取物對(duì)流感病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 依據(jù)“性味-功效”相關(guān)性理論和醫(yī)家的臨證思維方法，從性味配伍對(duì)銀翹散進(jìn)行拆方研究。通過銀翹散及其性味分組提取物抗Ⅳ感染MDCK細(xì)胞、小鼠實(shí)驗(yàn)，從抑制Ⅳ、誘生干擾素、抑制細(xì)胞凋亡等角度來探討銀翹散抗Ⅳ主要作用機(jī)制、主要生物效應(yīng)和方中藥物的最佳劑量配比關(guān)系，為銀翹散多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)抗Ⅳ作用提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法： 1.采用乙醇提取方法制備銀翹散及其性味分組提取物。 2.用Ⅳ滴鼻造成

2、小鼠感染模型，以小鼠肺組織中病毒的血凝滴度作為觀察指標(biāo)，運(yùn)用正交設(shè)計(jì)方法，觀察銀翹散各藥物配伍與藥效之間的關(guān)系。 3.建立Ⅳ感染細(xì)胞模型，通過先感染病毒后給藥、先給藥后感染病毒和藥物病毒同時(shí)作用三種給藥方式，采用CPE和MTT法觀察銀翹散及其性味分組提取物對(duì)Ⅳ感染MDCK細(xì)胞的作用。 4.采用DNA瓊脂糖凝膠電泳和TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;通過細(xì)胞爬片，采用免疫組化法檢測(cè)凋亡細(xì)胞Fas/FasL的表達(dá)，觀察銀翹散及其性味

3、分組提取物對(duì)Ⅳ感染MDCK細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。 5.建立小鼠Ⅳ肺炎模型，應(yīng)用RT-PCR和ELISA法檢測(cè)Ⅳ感染量及IFN-γ的含量，結(jié)合小鼠一般狀態(tài)、肺組織病理切片、形態(tài)學(xué)、肺指數(shù)等指標(biāo)，觀察銀翹散及其性味分組提取物對(duì)Ⅳ感染小鼠的作用。 6.采用TUNEL法和免疫組化法觀察小鼠肺組織細(xì)胞凋亡及Fas/FasL的表達(dá)，觀察銀翹散及其性味分組提取物對(duì)Ⅳ感染小鼠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。 結(jié)果： 1.通過直觀分

4、析和正交分析，銀翹散必要因素有連翹、金銀花、牛蒡子、荊芥穗、竹葉、生甘草、桔梗、薄荷(P＜0.05)，而淡豆豉的作用不明顯(P＞0.05)。 2.銀翹散及其性味分組對(duì)Ⅳ感染具有不同程度的治療作用，銀翹散組作用與藥物濃度呈正向關(guān)。銀翹散(1:1～1:4)及清熱解毒(1:1～1:2)組治療效果與病毒唑組比較無顯著性差異(P＞0.05)。銀翹散及其性味分組對(duì)Ⅳ具有較好的預(yù)防作用，銀翹散(1:1～1:8)、清熱解毒(1:1～1:8)、辛

5、涼解表(1:1～1:4)、辛溫解表(1:1～1:8)組與病毒唑組比較有顯著差異(P＜0.05)，銀翹散、清熱解毒、辛溫解表組作用與藥物濃度呈正向關(guān)。銀翹散及其性味分組對(duì)Ⅳ具有直接滅殺作用(P＜0.05)，其中銀翹散、清熱解毒組作用與藥物濃度呈正向關(guān)。銀翹散(1:1～1:2)、清熱解毒(1:1～1:4)、辛涼解表(1:1)組直接滅殺Ⅳ作用優(yōu)于病毒唑組(P＜0.05)，而辛溫解表組與病毒唑組比較無顯著差異(P＞0.05)。 3.銀翹

6、散及其性味分組和病毒唑組未出現(xiàn)凋亡“梯狀”圖譜，能降低凋亡指數(shù)(AI)，減少細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)Fas的吸光度(P＜0.05)。與病毒唑組相比，銀翹散、清熱解毒組無顯著性差異(P＞0.05)，而辛涼解表、辛溫解表組有顯著性差異(P＜0.05)。與病毒組相比，銀翹散、清熱解毒、辛涼解表組和病毒唑組能升高FasL的吸光度，有顯著性差異(P＜0.05)；與病毒唑組相比，銀翹散、清熱解毒組無顯著性差異(P＞0.05)，而辛涼解表組有顯著性差異(P＜0

7、.05)。 4.小鼠Ⅳ肺炎模型復(fù)制：肺組織中檢測(cè)到Ⅳ總RNA大量表達(dá)，肺指數(shù)增高，病理改變呈間質(zhì)性肺炎病變：肺泡間隔水腫、炎細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)漿液性滲出。 5.小鼠肺組織Ⅳ總RNA的表達(dá)：與病毒組比較，銀翹散及其性味分組和病毒唑組均有顯著差異(P＜0.05)，與病毒唑組比較，銀翹散、清熱解毒、辛涼解表組無顯著差異(P＞0.05)，辛溫解表組有顯著差異(P＜0.05)。 6.RT-PCR法測(cè)IFN-γ表達(dá)：與病毒組

8、比較，銀翹散、清熱解毒、辛溫解表組及病毒唑組有顯著差異(P＜0.05)，辛涼解表組無顯著差異(P＞0.05)；與病毒唑組比較，銀翹散、清熱解毒、辛涼解表組有顯著差異(P＜0.05)，辛溫解表組無顯著差異(P＞0.05)。ELISA法：Ⅳ感染小鼠，其肺組織中的IFN-γ含量明顯增多(P＜0.05)；與病毒組比較，銀翹散、清熱解毒組及病毒唑組有顯著差異(P＜0.05)，辛涼解表、辛溫解表組無顯著差異(P＞0.05)；與病毒唑組比較，銀翹散及

9、其性味分組均有顯著差異(P＜0.05)。 7.Ⅳ感染能夠誘導(dǎo)小鼠肺組織細(xì)胞凋亡，F(xiàn)as及FasL蛋白大量表達(dá)(P＜0.05)，銀翹散組、清熱解毒組能夠降低凋亡指數(shù)(AI)，抑制Ⅳ感染誘導(dǎo)小鼠肺組織的細(xì)胞凋亡(P＜0.05)，同時(shí)能下調(diào)肺組織中Fas/FasL蛋白表達(dá)(P＜0.05)。與病毒唑組FasL相比，銀翹散組無顯著性差異(P＞0.05)，清熱解毒組有顯著性差異(P＜0.05)。辛涼解表、辛溫解表組，與病毒組AI比較，無顯著

10、差異(P＞0.05)；與病毒唑組Fas相比，有顯著性差異(P＜0.05)；與正常組FasL比較，無顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論： 1.從降低Ⅳ滴鼻感染小鼠肺組織勻漿血凝滴度的角度看，銀翹散以連翹2金銀花2牛蒡子2荊芥穗。竹葉2生甘草2桔梗1薄荷2淡豆豉1治療效果好。 2.銀翹散及其性味分組對(duì)Ⅳ感染MDCK細(xì)胞具有預(yù)防、治療和直接滅殺作用。辛溫解表組對(duì)銀翹散直接滅殺Ⅳ作用的貢獻(xiàn)率不如其它二組。在不同的給藥方式

11、中，“先用藥后感染病毒”抑制病毒作用效果最好。 3.Ⅳ感染MDCK細(xì)胞能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。銀翹散及其性味分組能夠抑制Ⅳ誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過Fas/FasL途徑來實(shí)現(xiàn)，其中清熱解毒組起了主要作用。 4.銀翹散具有直接抑制Ⅳ、減少肺病理損傷和誘生干擾素作用，前二者是清熱解毒組、辛涼解表組、辛溫解表組三合方“整合”的結(jié)果，后者主要是通過清熱解毒組而奏效。 5.Ⅳ感染能夠誘導(dǎo)小鼠肺組織發(fā)生細(xì)胞凋亡。銀