不同時期鼻咽腔降溫對全腦缺血再灌注大鼠谷氨酸及Bcl-2、Bax的影響.pdf

1、目的：采用Pulsinelli四血管阻斷法致大鼠全腦缺血再灌注模型，并在不同時期實施鼻咽腔亞低溫，觀察海馬CAl區(qū)細胞外液谷氨酸（Glutamic acid，Glu）濃度（[Glu]e）和Bcl-2、Bax蛋白表達的變化，探討鼻咽腔亞低溫對全腦缺血再灌注損傷的腦保護時間窗。
　　 方法：
　　 1.實驗分組及動物模型制備
　　 Wistar雄性大鼠24只，體重250±20g（河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供）。隨機分

2、為4組（每組6只），常溫組（A組），缺血前降溫組（B組），缺血即刻降溫組（C組）和再灌注即刻降溫組（D組）。腹腔注射10％水合氯醛（0.3ml/100g）麻醉大鼠后，于頸后正中第一、二頸椎處切開皮膚，剝離顯露雙側翼小孔.燒灼兩側的椎動脈使其閉塞。24小時候后，再次麻醉大鼠，氣管插管，吸氧，保留自主呼吸。手術過程中間斷給予水合氯醛維持麻醉，持續(xù)監(jiān)測直腸溫度。右股靜脈切開置管以1ml/h的速度輸入乳酸鈉林格氏液。作頸前正中切開，分離出雙側頸

3、總動脈，用4-0絲線穿過頸總動脈，備用，部分縫合頸部傷口。兩側鼻腔插入自制硅膠管并固定，深度5mm。動物立體固定后，頭皮刺入電極，持續(xù)監(jiān)測腦電圖（EEG），四肢皮下刺入電極，持續(xù)監(jiān)測心電圖（ECG）。切開頭皮，用微型顱鉆在右側海馬CAl區(qū)（[前囟，bregma]后方3.6mm和中線旁開3mm）打開一直徑約2mm的圓孔，將溫度探頭刺入大腦皮側2mm，同樣的方法將微透析探針刺入左側海馬CAl區(qū)，以2.5μl/min的速度注入乳酸鈉林格氏液，

4、操作結束1小時腦電圖波形穩(wěn)定后，開始持續(xù)收集腦組織微透析液，間隔時間為10min，直至再灌注后2h。室溫保持在25℃。之后按照實驗分組給予不同處理。（1）常溫組（A組）：整個實驗中保持大鼠直腸和海馬溫度均為37±0.5℃，動脈夾夾閉雙側頸總動脈20min再灌注。（2）缺血前降溫組（B組）：通過鼻腔內(nèi)置入的硅膠管，輸入5℃生理鹽水，速度為100ml·min-1·kg-1，當海馬溫度降至33℃后，夾閉雙側頸總動脈20min再灌注，通過調(diào)節(jié)輸

5、入生理鹽水的速度保持海馬溫度33±0.5℃，并維持此溫1h。（3）缺血即刻降溫組（C組）：夾閉雙側頸總動脈同時開始鼻咽腔降溫，使海馬溫度降至33±0.5℃，并維持1h，夾閉雙側頸總動脈20min后再灌注。（4）再灌注即刻降溫組（D組）：夾閉雙側頸總動脈20min后，再灌注即刻實施鼻咽腔降溫至海馬溫度為33±0.5℃，并維持此溫度1h。后三組低溫結束后緩慢復溫至降溫前水平。以上四組均通過保溫維持直腸溫度37±0.5℃。
　　 2.

6、標本的采集及檢測方法
　　 2.1海馬CAl區(qū)細胞外液谷氨酸濃度的檢測
　　 微透析液收集后保存在-70℃。利用高效毛細管電泳法測定出各種濃度的谷氨酸標準品的峰面積，并繪制標準曲線、求得回歸方程。利用該方法測出每個樣品中谷氨酸的峰面積，根據(jù)回歸方程求得谷氨酸的濃度。
　　 2.2 Bcl-2、Bax表達的檢測
　　 再灌注8h后，大鼠深麻醉經(jīng)左心室-升主動脈插管，灌注生理鹽水50 ml以沖洗血液，然后快速

7、灌注4％多聚甲醛溶液50 ml，待全身僵硬后，斷頭打開顱骨完整取出腦組織，浸入4％多聚甲醛溶液中固定。Bcl-2、Bax免疫組化測定采用SP法進行，按照試劑盒要求步驟依次進行。
　　 結果：
　　 1.缺血中各組間海馬CAl區(qū)[Glu]e比較
　　 缺血10min，與A組、D組比較，B、C兩組[Glu]e明顯降低（P<0.05）； B組[Glu]e低于C組（P=0.037）； D組與A組比較差別無統(tǒng)計學意義（P>

8、0.05）。
　　 缺血20min，與A組、D組比較，B、C兩組[Glu]e明顯降低（P<0.05）。A組和D組，B組和C組比較差別無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 2.再灌注期間各組海馬CAl區(qū)[Glu]e比較
　　 再灌注后10min、20min，B、C和D組海馬CAl區(qū)[Glu]e均明顯低于A組（P<0.05）。與D組比較，B、C兩組均明顯降低（P<0.01）。
　　 再灌注后30min，B、C

9、、D組海馬CAl區(qū)[Glu]e明顯低于A組（P<0.05），B、C、D三組之間兩兩比較差別無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 3.各組內(nèi)海馬CAl區(qū)[Glu]e恢復至缺血前水平所需時間的比較
　　 A、B、C和D四組海馬CAl區(qū)[Glu]e恢復至缺血前水平所需時間分別為40min、20min、20min和30min。
　　 4.各組間海馬CAl區(qū)Bcl-2表達的比較
　　 與A組比較，B、C、D三組海馬

10、CAl區(qū)Bcl-2均明顯升高（P<0.05）；B、C、D三組兩兩比較差別均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 5.各組間海馬CAl區(qū)Bax表達的比較
　　 與A組比較，B、C、D三組海馬CAl區(qū)Bax表達均明顯降低（P<0.05）；B、C、D三組兩兩比較差別均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 結論：
　　 1.不同時期鼻咽腔降溫對腦缺血再灌注損傷均有一定保護作用。
　　 2.從谷氨酸變化觀察