誘導(dǎo)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物預(yù)致敏同種腎臟移植“適應(yīng)”的研究.pdf

1、因輸血、妊娠、多次移植等原因成為預(yù)致敏的高危受體病人，在接受同種異體器官移植后易發(fā)生較嚴(yán)重的體液性排斥反應(yīng)，如超急性、加速性或急性血管性排斥反應(yīng)。
　　 且隨著器官移植開(kāi)展歷史的延長(zhǎng)，等待接受二次、甚至三次移植的預(yù)致敏患者將越來(lái)越多。目前臨床針對(duì)這些預(yù)致敏患者的“脫敏”治療，價(jià)格昂貴、副作用大、效果不穩(wěn)定且僅適用于部分病人。我們擬建立非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物皮膚預(yù)致敏后腎臟移植的動(dòng)物研究模型，嘗試應(yīng)用“適應(yīng)”策略誘導(dǎo)移植腎的長(zhǎng)期存活，并闡

2、述其相關(guān)機(jī)制。
　　 準(zhǔn)確的鑒定非人靈長(zhǎng)類的血型是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物器官移植研究的基礎(chǔ)。非人靈長(zhǎng)類的ABO 血型抗原都表達(dá)在組織器官內(nèi)，而不是在紅細(xì)胞上，這給非人靈長(zhǎng)類血型的鑒定帶來(lái)很大的困難。為找到更加簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確鑒定非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物類人ABO 血型的方法，采用近年來(lái)臨床上廣泛應(yīng)用的卡式微柱凝膠正、反定型法對(duì)38只獼猴和26只食蟹猴的血型進(jìn)行了鑒定，并與腎組織免疫組化法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果顯示：卡式微柱凝膠正定型法

3、的檢測(cè)結(jié)果中無(wú)一例為陽(yáng)性結(jié)果；血漿中的纖維蛋白原和人-猴種屬間非特異性抗體都會(huì)對(duì)卡式微柱凝膠反定型法的部分檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾；采用經(jīng)正常人O型紅細(xì)胞吸附處理后的清亮血清，卡式微柱凝膠反定型法的檢測(cè)結(jié)果明確，與免疫組化法判定結(jié)果一致。由此得出：采用經(jīng)人正常O型紅細(xì)胞吸附處理后的清亮血清作為樣本，卡式微柱凝膠反定型法可以準(zhǔn)確的判定獼猴或食蟹猴的血型，是個(gè)更為簡(jiǎn)單、快捷的方法，推薦為非人靈長(zhǎng)類血型檢測(cè)的常規(guī)方法。
　　 建立非人靈長(zhǎng)類預(yù)

4、致敏后腎臟移植加速性排斥反應(yīng)模型。取血型相容的正常獼猴配對(duì)，預(yù)先將供體腹部全層皮膚移植到受體背部，使受體預(yù)致敏。2 周后再將同一供體的左側(cè)腎臟移植到受體腹腔內(nèi)，同時(shí)切除受體猴自體雙腎。以未致敏的猴腎移植作為對(duì)照，觀察術(shù)后受體猴血肌酐水平變化，移植物存活時(shí)間及病理特點(diǎn)；觀察臨床常用的CsA 為基礎(chǔ)的三聯(lián)免疫抑制治療（CsA+MMF+強(qiáng)的松）是否可以延長(zhǎng)該模型移植物存活時(shí)間。結(jié)果顯示：4例未致敏腎移植猴（對(duì)照組，第1組）的存活時(shí)間分別為9、

5、18、8和7天；3例致敏后腎移植猴（致敏后未用藥組，第2組）的存活時(shí)間分別為3、3和4天；3例致敏后腎移植猴行CsA 三聯(lián)免疫抑制治療（致敏后用藥組，第3組），存活時(shí)間分別為2、3和4天。我們得出結(jié)論：①受體猴被供體皮膚預(yù)致敏后再行腎臟移植，可以加速移植物的排斥反應(yīng)，是首個(gè)更加接近于人類預(yù)致敏后排斥反應(yīng)特點(diǎn)的大動(dòng)物研究模型。②該模型模擬的預(yù)致敏后加速性排斥反應(yīng)不能被CsA 三聯(lián)免疫抑制治療方案逆轉(zhuǎn)。
　　 觀察非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物預(yù)致

6、敏后腎臟移植加速性排斥反應(yīng)的免疫學(xué)及病理學(xué)變化。采用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物皮膚預(yù)致敏后腎臟移植加速性排斥反應(yīng)模型，檢測(cè)皮膚移植預(yù)致敏前后及腎移植后受體猴血清內(nèi)供體特異性抗體的變化，并在發(fā)生排斥反應(yīng)時(shí)對(duì)移植腎進(jìn)行免疫組化（測(cè)定補(bǔ)體、抗體的沉積和各類型淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況）及病理學(xué)分析。
　　 結(jié)果顯示：3例致敏未用藥受體猴均發(fā)生了加速性排斥反應(yīng)。2例受體猴在預(yù)致敏后血清中供體特異性抗體明顯增加，對(duì)供體的淋巴毒反應(yīng)明顯升高；腎移植后受者血清中供

7、體特異性抗體及針對(duì)供體的淋巴毒進(jìn)一步升高。HE 染色顯示被排斥的移植腎內(nèi)明顯的動(dòng)脈壞死、血栓形成、間質(zhì)出血、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；免疫組化及熒光染色顯示移植腎內(nèi)有大量的補(bǔ)體、抗體沉積（主要為IgG），而少見(jiàn)各類型的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。1例受體猴體內(nèi)的供體特異性抗體及對(duì)供體淋巴毒反應(yīng)的升高程度不如前2例明顯，病理學(xué)變化以腎小管損傷為主。與致敏不用藥組相比，用藥組的3例受體猴移植腎被排斥的病理學(xué)變化較輕，沒(méi)有典型的動(dòng)脈壞死、血栓形成或中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)

8、的情況，但仍有一定量的抗體和補(bǔ)體沉積，同時(shí)伴有一定量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 我們得出結(jié)論：
　　 綜合本部分的研究，我們得出以下結(jié)論：①非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物預(yù)致敏后腎臟移植加速性排斥反應(yīng)的免疫學(xué)機(jī)制為：皮膚移植預(yù)致敏可以誘導(dǎo)受體猴產(chǎn)生程度不等的預(yù)存抗體，導(dǎo)致大部分移植腎在術(shù)后早期發(fā)生主要由抗體和補(bǔ)體介導(dǎo)的嚴(yán)重的急性體液性排斥反應(yīng)。②其病理學(xué)特點(diǎn)為：以大量出血、壞死、血栓形成、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主；
　　 有大量抗體和補(bǔ)體

9、片段沉積；較少的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為特點(diǎn)。③CsA 三聯(lián)免疫抑制治療方案雖然不能延長(zhǎng)預(yù)致敏非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的移植腎存活時(shí)間，但可以明顯減輕移植腎的病理學(xué)變化，提示繼續(xù)改進(jìn)和加強(qiáng)免疫抑制治療方案仍有可行性。
　　 針對(duì)預(yù)存抗體導(dǎo)致的體液性排斥反應(yīng)，在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物預(yù)致敏后同種異體腎移植模型中研究短期補(bǔ)體抑制誘導(dǎo)“適應(yīng)”的可行性及相關(guān)機(jī)制，以期為臨床預(yù)致敏高危移植探索出一種簡(jiǎn)便易行的新方法。以獼猴為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，先行供體皮膚移植致敏 14天后再

10、行腎移植術(shù)，建立預(yù)致敏同種異體腎移植模型。在CsA 三聯(lián)治療的基礎(chǔ)上加用國(guó)產(chǎn)高純度眼鏡蛇毒因子（CVF）短期抑制補(bǔ)體活性（第4組）（n=5）。觀察移植腎存活時(shí)間，檢測(cè)抗供體特異性抗體及淋巴毒的變化，定期穿刺活檢標(biāo)本或按計(jì)劃切取的移植腎標(biāo)本行HE 染色以及一系列免疫組化檢測(cè)。結(jié)果顯示，在移植后2 周內(nèi)加用CVF 治療幾乎可以完全清除受者循環(huán)中的補(bǔ)體C3，移植腎存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)(41，140,>250，>500，>700天)，與前3組比較有

11、顯著性差異（P<0.05）。免疫學(xué)及病理學(xué)研究顯示，加用CVF 治療的第4組在移植腎活檢組織中僅有一定的抗體沉積，補(bǔ)體成分的沉積極少，雖然停用CVF后受者血清補(bǔ)體C3 水平和CH50 均恢復(fù)到正常水平，但移植腎仍能長(zhǎng)期存活，另外可見(jiàn)保護(hù)性基因Bcl-2和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46、CD59的表達(dá)明顯上調(diào)。我們得出結(jié)論：在CsA 三聯(lián)免疫抑制維持治療基礎(chǔ)上，短期抑制受者補(bǔ)體活性顯著延長(zhǎng)預(yù)致敏后腎移植存活，大部分動(dòng)物的移植腎在補(bǔ)體水平恢復(fù)正常后仍

12、能存活良好，成功誘導(dǎo)出“適應(yīng)”，其機(jī)制可能與移植物內(nèi)保護(hù)性基因Bcl-2和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的明顯上調(diào)表達(dá)有關(guān)。為解決臨床預(yù)致敏高危移植的難題提供了極具參考價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 在以往的研究基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒因子（CVF）在器官移植領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。為此，我們對(duì)其理化性質(zhì)和免疫原性進(jìn)行深入研究。采用的云南孟加拉種眼鏡蛇蛇毒因子（Y-CVF）較文獻(xiàn)報(bào)道的其它各種CVF 具有更高的活性和較少的用藥量。為探討Y-CVF 靜脈使用

13、是否誘導(dǎo)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生特異性中和抗體和異種天然抗體，本研究給2只正常食蟹猴每2 周靜脈注射一次治療劑量的Y-CVF（0.05mg/kg），共4 次，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)血清內(nèi)補(bǔ)體C3 水平、總補(bǔ)體活性（CH50）、抗Y-CVF 抗體和抗豬內(nèi)皮細(xì)胞異種抗體的變化。結(jié)果顯示，前2 次注射Y-CVF 均有良好的清除補(bǔ)體效果，第3 次注射Y-CVF時(shí)補(bǔ)體僅被部分滅活，第4 次注射Y-CVF則基本無(wú)效。Western Blot和ELISA 均證

14、實(shí)特異性抗Y-CVF 抗體產(chǎn)生，且其滴度隨著Y-CVF 注射次數(shù)增加而遞增。多次注射Y-CVF后，并沒(méi)有在血清內(nèi)檢測(cè)到明顯的抗豬內(nèi)皮細(xì)胞抗體的變化。同時(shí)，在本研究中，我們還觀察了2例前期研究中長(zhǎng)期存活的獼猴。在這2例獼猴的用藥方案中，Y-CVF和CsA+MMF+Pred 聯(lián)合使用，且僅在術(shù)后早期2 周內(nèi)多次小劑量使用。我們?cè)讷J猴體內(nèi)的補(bǔ)體水平恢復(fù)正常后，對(duì)血清內(nèi)的抗Y-CVF 抗體進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有很高滴度的中和抗體存在。在整個(gè)Y-

15、CVF治療過(guò)程中，補(bǔ)體C3 水平一直維持在極低水平，也沒(méi)有Y-CVF 注射無(wú)效的現(xiàn)象。我們因此得出結(jié)論：①Y-CVF 是一種具有更高抑制補(bǔ)體活性的蛇毒因子。②Y-CVF 具有一定的免疫原性。單獨(dú)使用能誘導(dǎo)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體，從而導(dǎo)致Y-CVF失效。③Y-CVF 未誘導(dǎo)抗豬抗體（含抗α-Gal 抗體）的水平升高。④在聯(lián)合使用免疫抑制劑的基礎(chǔ)上，短期多次小劑量使用Y-CVF，可以明顯降低中和抗體的產(chǎn)生，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

16、>　　 總之，我們首先創(chuàng)建了簡(jiǎn)單的、準(zhǔn)確的鑒定非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物血型的新方法，成功的建立了非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的預(yù)致敏腎臟移植加速性排斥反應(yīng)模型。并在此基礎(chǔ)上，首次在非人靈長(zhǎng)類預(yù)致敏后成功獲得同種腎臟移植的長(zhǎng)期存活，并誘導(dǎo)出“適應(yīng)”現(xiàn)象。
　　 我們也對(duì)該“適應(yīng)”現(xiàn)象的機(jī)制進(jìn)行了一定的探討，發(fā)現(xiàn)其機(jī)制可能與保護(hù)基因BcL-2的高表達(dá)有關(guān)。另外，我們也首次在大動(dòng)物“適應(yīng)”現(xiàn)象中，觀察到補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46和CD59的高表達(dá)現(xiàn)象，這可能是“