冬小麥抗寒相關(guān)miR319及其靶基因(TC444396)的表達(dá)分析與功能探究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是非常重要的轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)調(diào)控因子，在植物生長發(fā)育和逆境中起重要調(diào)控作用，其調(diào)控作用不僅涉及植物組織器官的生長發(fā)育、免疫反應(yīng)、激素調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，且參與植物對多種生物和非生物脅迫（干旱、鹽漬、低溫、營養(yǎng)等脅迫）的響應(yīng)。
　　小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，其生產(chǎn)遍布世界各地。嚴(yán)寒是限制黑龍江地區(qū)種植冬小麥的最主要原因，東農(nóng)冬麥1號是黑龍江高寒地區(qū)首例能夠安全越冬的強(qiáng)抗寒冬小麥品種，探討miRNA對其抗寒性的

2、影響具有重要的理論和實(shí)踐意義。目前，對miRNA的逆境調(diào)控研究多集中在基因組測序的物種中。本研究以東農(nóng)冬麥1號為材料，以實(shí)驗(yàn)室前期得到的6條寒脅迫下表達(dá)差異顯著的miRNAs為對象，在田間自然降溫至5℃、-10℃、-25℃時，比較6個miRNAs及其靶基因響應(yīng)寒脅迫后表達(dá)模式的變化?？寺re-tae-miR319并構(gòu)建融合Pre-tae-miR319的過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥并進(jìn)行miR319瞬時表達(dá)模式的檢測。研究結(jié)果如下:
　

3、　(1)在田間自然降溫至5℃、-10℃、-25℃時，實(shí)時熒光定量分析miRNAs及其靶基因表達(dá)量顯示:隨著溫度的降低，東農(nóng)冬麥1號根莖中miR319、1118、1120、1128、1133和1139表達(dá)量，呈先降后升的變化趨勢，其靶基因表達(dá)量相反，表現(xiàn)為先升后降，表明miRNA表達(dá)模式的改變與其靶基因的功能相關(guān)。上述3個低溫中，-10℃時6條miRNAs的表達(dá)量均達(dá)到最低值，-25℃時表達(dá)量顯著增加;-10℃時其靶基因的表達(dá)量均達(dá)峰值，

4、-25℃時顯著降低。表明-10℃低溫是東農(nóng)冬麥1號中寒脅迫相關(guān)miRNAs響應(yīng)低溫的溫度轉(zhuǎn)折點(diǎn)。
　　(2)在線psRNATarget軟件預(yù)測低溫脅迫后響應(yīng)表達(dá)差異顯著的上述6條miRNAs的靶基因，共包含89個靶基因。從6條miRNAs中挑選出具有較強(qiáng)保守性的tae-miR319，5'RACE(rapid amplification of cDNA ends）法驗(yàn)證tae-miR319對其靶基因CBF轉(zhuǎn)錄因子(TC444396）

5、的切割位點(diǎn)是tae-miR319的5'末端第10個、第11個核苷酸之間、此作用位點(diǎn)位于TC444396編碼區(qū)。
　　(3)克隆東農(nóng)冬麥1號Pre-tae-miR319并插入植物表達(dá)載體，成功構(gòu)建融合Pre-tae-miR319的過表達(dá)載體pCMBIA230035Su后用花粉管通道方法轉(zhuǎn)染擬南芥、獲得過表達(dá)植株。對轉(zhuǎn)化后擬南芥植株經(jīng)4℃脅迫0h、24h、48h、72h后，檢測葉片中miR319及其靶基因的瞬時表達(dá)量，結(jié)果表明:4℃處