人野生型p53基因增強5-FU對大腸癌化療敏感性的分子生物學機制.pdf

1、目的：利用p53基因突變的大腸癌細胞，探討人野生型p53(wt—p53)基因增強5-FU對大腸癌細胞化療敏感性的分子生物學機制，為進一步研究腫瘤基因治療提供理論依據(jù)。 方法： 一、將攜帶wt—p53基因的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染兩種p53基因突變的人大腸癌細胞HT-29及SW620，以含綠色熒光蛋白GFP的質(zhì)粒作為對照，Western blot分析細胞中p53及細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)蛋白的表達水平。 二、通過

2、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)檢測Cyclin D1 mRNA在轉(zhuǎn)染了wt-p53基因的細胞中的表達情況。 三、將化療藥物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)以不同濃度或不同時間分別作用于HT-29及SW620細胞，另外將已轉(zhuǎn)染wt—p53基因的大腸癌細胞用5-FU進行誘導，Western blot分析上述干預(yù)條件下細胞中p53及Cyclin D1蛋白表達水平的變化。 四、流式細胞術(shù)(FCM)檢測

3、wt—p53基因聯(lián)合5-FU組及各對照組中細胞凋亡的改變情況。 結(jié)果： 一、Western blot顯示轉(zhuǎn)染wt—p53基因的HT-29及SW620細胞中CyclinD1蛋白的表達水平明顯升高，與wt—p53基因呈劑量依賴性關(guān)系。 二、RT—PCR證實Cyclin D1蛋白上調(diào)不影響其mRNA在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平。 三、細胞中CyclinD1蛋白的表達水平在5-FU作用下出現(xiàn)明顯下降，并與5-FU呈時間和劑