昆蟲幾個(gè)蛻皮相關(guān)酶的表達(dá)和功能分析.pdf

1、蛻皮是線蟲和節(jié)肢動(dòng)物等蛻皮類動(dòng)物特有的生命現(xiàn)象，是昆蟲發(fā)育變態(tài)的重要程序之一，也是昆蟲個(gè)體生長所必需的生命過程。蛻皮包括真皮細(xì)胞活動(dòng)加強(qiáng)、表皮分離、蛻皮液分泌、新表皮形成、舊表皮蛻去等一系列連續(xù)的過程。在這些過程中，與其相關(guān)的酶表達(dá)也在發(fā)生著重大的變化。
　　本研究通過對家蠶和牧草盲蝽幾種蛻皮相關(guān)酶的表達(dá)量分析，明確了蛻皮激素與蛻皮過程中的酶類尤其是酚氧化酶，多巴脫羧酶及幾丁質(zhì)酶密切相關(guān)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)克隆并

2、鑒定了家蠶酚氧化酶原基因(BmPPO)。家蠶酚氧化酶原基因由PPO1和PPO2兩種同工酶構(gòu)成。家蠶酚氧化酶原Ⅰ(BmPPO1) ORF全長2058 bp，編碼685個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為79 kDa，等電點(diǎn)為6.25。家蠶酚氧化酶原Ⅱ(BmPPO2)的ORF全長2082 bp，編碼693個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為80kDa，等電點(diǎn)為5.6。通過定量分析酚氧化酶在小蠶期和大蠶期各組織的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，表明酚氧化酶在小蠶期的

3、表達(dá)趨勢與家蠶蛻皮過程吻合，即蛻皮時(shí)表達(dá)量較高，而后下降。酚氧化酶在大蠶期各組織中的表達(dá)差別較大，在血淋巴和頭部表達(dá)量較高，在表皮和生殖器官中表達(dá)量較低。人工添食蛻皮激素確定血淋巴中蛻皮激素含量明顯升高的情況下，家蠶體內(nèi)酚氧化酶表達(dá)量明顯地升高，說明酚氧化酶是蛻皮過程中非常關(guān)鍵的酶類并且其表達(dá)受蛻皮激素的影響。PPO1 RNA干擾后家蠶幼蟲酚氧化酶基因表達(dá)量明顯下降，蛹期表型出現(xiàn)少數(shù)的不完全化蛹現(xiàn)象。但RNA干擾后的表型效果不明顯，可能

4、是由于家蠶體內(nèi)酚氧化酶不是單一的一種酶，而是一組酶。當(dāng)干擾一種酚氧化酶，其干擾效果被其他的酚氧化酶彌補(bǔ)。RNA干擾后不同組織的酚氧化酶活性變化趨勢不同，頭部和血淋巴中酚氧化酶活性顯著高于對照，但在表皮中RNA干擾導(dǎo)致了酚氧化活性的下降，說明RNA干擾對不同組織的作用效果不同，可能在不同組織間具有協(xié)調(diào)作用。
　　(2)克隆并鑒定了家蠶多巴脫羧酶(BmDdc)基因。多巴脫羧酶ORF全長1437 bp，編碼478個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測蛋白質(zhì)

5、分子質(zhì)量為54 kDa，等電點(diǎn)為5.8。通過Real-TimePCR熒光定量對多巴脫羧酶在小蠶期和大蠶期各組織的表達(dá)量分析，表明多巴脫羧酶在2齡前的表達(dá)量較低，在2齡眠蠶表達(dá)量大幅上升，而后下降;小蠶后期表現(xiàn)有規(guī)律的表達(dá)趨勢，基本上是在眠蠶時(shí)期表達(dá)量高。BmDdc在大蠶期（5齡）的表皮、頭部和生殖腺的表達(dá)量變化比較大，在熟蠶和蛹前有相對較高的表達(dá)量。人工添食蛻皮激素確定血淋巴中蛻皮激素含量明顯升高的情況下，家蠶體內(nèi)多巴脫羧酶表達(dá)量與對照

6、相比明顯升高，說明多巴脫羧酶表達(dá)受蛻皮激素的影響，是蛻皮過程中關(guān)鍵性的酶類。BmDdc RNA干擾家蠶幼蟲24hr表達(dá)量明顯的下降，蛹期表型出現(xiàn)34.4％不完全化蛹或者不化蛹表型，干擾效果明顯。用液相色譜檢測RNA干擾后不同組織的多巴脫羧酶活性，發(fā)現(xiàn)不同組織變化趨勢不大。原核表達(dá)多巴脫羧酶并制作抗體，大小符合理論值。多抗檢測其在近細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成表達(dá)，而后通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外參與體表的硬化和鞣化。推測多巴脫羧酶在未蛻皮前

7、在細(xì)胞內(nèi)大量合成，蛻皮后釋放到細(xì)胞外發(fā)揮作用。組織免疫熒光檢測表明，其主要在頭部的表面和神經(jīng)器官及表皮的真皮層表達(dá)，這與其作用相一致。
　　(3)測定了牧草盲椿的蛻皮激素滴度，其在雌雄昆蟲表現(xiàn)高度的一致性，即5齡的中后期升高，變態(tài)完成后降低，這與蛻皮激素的作用一致。我們克隆了可能與蛻皮激素相關(guān)的幾種酶的ORF,并對其進(jìn)行不同時(shí)期和組織的表達(dá)量分析。結(jié)果表明，只有牧草盲椿幾丁質(zhì)酶基因表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性和一致性，且表達(dá)規(guī)律與蛻皮過程相

8、協(xié)調(diào)。蛻皮激素的早期誘導(dǎo)（剛孵化的5齡若蟲）明顯提高了昆蟲的死亡率，尤其是在若蟲期，同時(shí)也明顯降低了其變態(tài)率，并導(dǎo)致幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)推遲。蛻皮激素晚期誘導(dǎo)（5齡第6天，16.9℃條件下5齡持續(xù)約12天）同樣會(huì)增加昆蟲的死亡率，但是在成蟲期表現(xiàn)更為明顯，且變態(tài)效率顯著降低。同時(shí)蛻皮激素延長單個(gè)昆蟲的蛻皮過程，對蛻皮的阻滯作用強(qiáng)于早期誘導(dǎo)，最終導(dǎo)致20％以上的昆蟲在變態(tài)過程中死亡，這表明高濃度的蛻皮激素阻滯而非像其他昆蟲那樣促進(jìn)盲椿的變態(tài)發(fā)

9、育。
　　對于蛻皮機(jī)制的研究可幫助我們了解昆蟲的生命規(guī)律，同時(shí)利用其生命階段的某些特征來對相關(guān)農(nóng)業(yè)害蟲進(jìn)行防治或者對益蟲充分地利用。蛻皮激素對于蛻皮過程的綜合調(diào)控可應(yīng)用于實(shí)際的生產(chǎn)中:如家蠶5齡末期使用蛻皮激素，能使家蠶齡期縮短，促進(jìn)老熟變態(tài)，吐絲營繭速度相對加快，這可作為缺桑葉時(shí)一種提早上蔟的應(yīng)急措施，并提高上蔟整齊度。牧草盲椿蛻皮激素對其變態(tài)過程的阻滯作用可用于害蟲控制。因此闡明昆蟲蛻皮相關(guān)基因表達(dá)和調(diào)控，將為害蟲防治和益蟲生