β-TCP多孔生物陶瓷軟骨組織工程支架的研發(fā)及應(yīng)用研究.pdf

1、【目的】:β-TCP是一種較理想的骨組織工程無(wú)機(jī)支架材料,傳統(tǒng)的β-TCP生物陶瓷制作方法制作的生物陶瓷,其微結(jié)構(gòu)難以控制,應(yīng)用于軟骨組織工程的較少。近年來(lái)法國(guó)地中海大學(xué)成功地研制了微孔結(jié)構(gòu)可控的β-磷酸三鈣多孔陶瓷材料,該材料不僅具有良好的生物相容性和較高的機(jī)械強(qiáng)度,而且可調(diào)控微結(jié)構(gòu)以適合軟骨組織工程構(gòu)建的需要。我們和上海貝奧路公司合作,通過(guò)研究不同微結(jié)構(gòu)的生物陶瓷支架復(fù)合軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)適合軟骨組織工程構(gòu)建的生物陶瓷支架

2、材料微結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)兔解剖結(jié)構(gòu)的測(cè)量,建立兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型,進(jìn)行體內(nèi)生物陶瓷支架軟骨修復(fù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),觀察并評(píng)估軟骨修復(fù)效果,從而找到適合體內(nèi)軟骨組織構(gòu)建的生物陶瓷支架。為β-TCP材料進(jìn)一步臨床應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　【方法】:(一)選取二月齡健康新西蘭大白兔,耳緣靜脈注射空氣栓塞處死,取雙側(cè)股骨髁、肱骨及脛骨,剔除周?chē)浗M織,分別使用游標(biāo)卡尺及64排CT重建進(jìn)行測(cè)量,獲取各項(xiàng)解剖數(shù)據(jù)。(二)消化分離成年兔肋軟骨

3、細(xì)胞及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),觀察兩種軟骨細(xì)胞的細(xì)胞獲得率、存活率、細(xì)胞貼壁率、形態(tài)學(xué)變化、MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖速度,并且進(jìn)行甲苯胺蘭染色、亮綠-番紅花“0”染色、二甲基亞甲基藍(lán)法測(cè)定硫酸糖胺多糖。從而優(yōu)選出適合軟骨組織工程研究的合適的軟骨細(xì)胞及其傳代數(shù)。(三)通過(guò)對(duì)肋軟骨細(xì)胞復(fù)合不同微結(jié)構(gòu)的生物陶瓷材料進(jìn)行體外培養(yǎng),計(jì)算軟骨細(xì)胞在支架內(nèi)增殖生長(zhǎng)的不同趨勢(shì),優(yōu)選出適合軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的β-TCP生物陶瓷支架的合適微結(jié)構(gòu)。(四)利用專(zhuān)利技術(shù)

4、,在前期研究的基礎(chǔ)上,燒結(jié)出適合軟骨組織工程構(gòu)建的具有合適微結(jié)構(gòu)的β-TCP生物陶瓷支架材料。(五)將體外實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的適合軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的微結(jié)構(gòu)的β-TCP生物陶瓷支架材料復(fù)合肋軟骨細(xì)胞植入兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中,以驗(yàn)證該微結(jié)構(gòu)修復(fù)動(dòng)物體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性。
　　【結(jié)果】:(一)解剖測(cè)量的結(jié)果得到了兔股骨髁、肱骨及脛骨的各項(xiàng)數(shù)據(jù),并且進(jìn)行了CT三維重建,測(cè)量結(jié)果顯示肱骨頭軟骨面至骺線(xiàn)距離4.5±0.2mm。脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)寬度為6.1±

5、0.4mm,外側(cè)平臺(tái)寬度為6.4±0.3mm,但脛骨平臺(tái)表面覆蓋有半月板組織,無(wú)法進(jìn)行手術(shù)顯露,這兩個(gè)部位都無(wú)法滿(mǎn)足體內(nèi)試驗(yàn)的需要。股骨內(nèi)側(cè)髁寬度為5.0±0.2mm,外側(cè)髁寬度為4.0±0.1mm,兩側(cè)髁的寬度都較小,并且表面形態(tài)較不規(guī)整,同樣不滿(mǎn)足體內(nèi)試驗(yàn)的需要。股骨滑車(chē)寬度為6.5±0.5mm,滑車(chē)近髁間窩表面軟骨至髓腔距離為9.1±0.6mm,并且表面形態(tài)較規(guī)整,可以適合體內(nèi)試驗(yàn)的需要。(二)利用專(zhuān)利技術(shù)進(jìn)行適合軟骨組織工程研究

6、的合適微結(jié)構(gòu)β-TCP生物陶瓷支架材料的燒制,并且進(jìn)行相關(guān)理化性能的表征檢測(cè)。(三)兩種軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的結(jié)果顯示關(guān)節(jié)軟骨:消化時(shí)間為6.49±1.87h,細(xì)胞獲得率為5.79±1.7×10 5/100mg。肋軟骨:消化時(shí)間為4.14±1.45h,細(xì)胞獲得率為4.76±1.2×10 5/100mg,肋軟骨細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在細(xì)胞獲得率、存活率、貼壁率上都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而肋軟骨細(xì)胞的消化時(shí)間卻低于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,P值為0.0032。二甲

7、基亞甲基藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞傳代培養(yǎng)液中GAG的含量,顯示1代軟骨細(xì)胞及2代軟骨細(xì)胞分泌GAG的量和原代細(xì)胞相似無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但從第3代軟骨細(xì)胞開(kāi)始則開(kāi)始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(四)對(duì)軟骨細(xì)胞復(fù)合不同微結(jié)構(gòu)的支架材料培養(yǎng)的結(jié)果顯示,培養(yǎng)第一周,不同內(nèi)連接徑及孔徑的支架材料中種植的肋軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)速度無(wú)明顯差異,但是從第二周開(kāi)始,在孔徑相同的條件下內(nèi)連接徑120μm的支架材料生長(zhǎng)速度明顯快于其他內(nèi)連接徑的支架材料,這種情況一直延續(xù)到第四周。(五)進(jìn)行體

8、內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)認(rèn)證,結(jié)果證明肋軟骨細(xì)胞復(fù)合β-TCP生物陶瓷材料可以修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損,4月后的2代肋軟骨細(xì)胞組組織學(xué)評(píng)分為20.76±2.13,甲苯氨蘭、番紅及Ⅱ型膠原染色均顯示軟骨組織修復(fù)較為完全。
　　【結(jié)論】:兔股骨滑車(chē)近髁間窩軟骨缺損的動(dòng)物模型是有效的,適合軟骨細(xì)胞組織工程研究。軟骨種子細(xì)胞優(yōu)選的結(jié)果發(fā)現(xiàn)肋軟骨細(xì)胞在體外生長(zhǎng)速度較快,分泌糖胺聚糖的量更多,從體外擴(kuò)增數(shù)量的角度出發(fā),2代軟骨細(xì)胞較適合軟骨組織工程構(gòu)建的需要。微

9、結(jié)構(gòu)不同的生物陶瓷支架材料對(duì)肋軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的結(jié)果是有差異的,孔徑為500-630μm,內(nèi)連接徑120m的生物陶瓷材料體外培養(yǎng)較適合軟骨細(xì)胞體外生長(zhǎng)的需要。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同的復(fù)合方式軟骨修復(fù)結(jié)果是有差異的。肋軟骨細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)至2代后復(fù)合生物陶瓷支架材料修復(fù)動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨缺損的結(jié)果較原代消化細(xì)胞直接復(fù)合支架材料修復(fù)動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨缺損效果為好。硬質(zhì)生物陶瓷材料完全可以作為軟骨工程的支架材料。硬質(zhì)支架材料上層軟骨細(xì)胞成軟骨,下層軟