靈芝三萜的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其對前列腺癌作用的研究.pdf

1、靈芝(Ganoderma lucidum)在我國已有上千年的藥用歷史,近年來靈芝三萜類化合物因被報道具有多用藥理活性而引起了國內(nèi)外學(xué)者們的廣泛關(guān)注,迄今為止已從靈芝中已分離得到了160余種三萜類化合物。但究竟該如何來開發(fā)和應(yīng)用靈芝中的三萜類化合物?它們又究竟有哪些藥理活性?它們是通過何種途徑來發(fā)揮它們的藥理作用?這些問題都成了近年來靈芝三萜的研究和應(yīng)用中亟待解決的問題。因此,本研究選用當(dāng)今世界上最為先進(jìn)的萃取技術(shù)之一,即超臨界 CO2萃

2、取(SFE-CO2)技術(shù)萃取靈芝子實(shí)體中的三萜成分,再以抗前列腺癌細(xì)胞增殖的生物活性為活性跟蹤手段對靈芝中的三萜類化合物進(jìn)行系統(tǒng)的分離純化,然后再對分離得到的活性成分對抗前列腺癌的作用機(jī)制進(jìn)行研究。整個研究過程將提取和分離純化工藝的研究與生物活性的研究相結(jié)合,為合理地開發(fā)和利用靈芝產(chǎn)品提供科學(xué)的數(shù)據(jù)。
　　在采用超臨界 CO2技術(shù)萃取靈芝子實(shí)體中的三萜成分的實(shí)驗(yàn)中,本論文通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定的最佳萃取條件為:子實(shí)體粒度10

3、目、夾帶劑95％乙醇、壓力35 Mpa、溫度40℃、時間2.5 h、CO2流量35 g/min、夾帶劑體積:子實(shí)體重為6:1(mL/g),在此工藝條件下,萃取物的得率為2.42%,總?cè)频牡寐蕿?.98%,萃取物中三萜的含量為40.5%。由HPLC圖譜分析可知,SFE-CO2萃取靈芝子實(shí)體三萜的過程中不同的工藝條件下獲得的萃取物中靈芝三萜的種類并沒有差異,只是在靈芝三萜的含量上有差異。但各個正交試驗(yàn)的萃取物對腫瘤細(xì)胞K562的抑制實(shí)驗(yàn)表

4、明,SFE-CO2萃取物對K562的抑制作用與萃取物中三萜的含量呈正相關(guān),最優(yōu)條件下的SFE-CO2萃取物中三萜的含量最高,高達(dá)40.5%。在作用濃度為250μg/mL時,其對K562的抑制率也最高,可達(dá)71.36%。與傳統(tǒng)的醇提法相比,SFE-CO2法中粗提物和總?cè)频妮腿÷示缘?但其粗提物中三萜的含量較高,且HPLC結(jié)果顯示,SFE-CO2的粗提物中三萜的種類較多。另外,本論文還利用體外抗腫瘤、抗神經(jīng)細(xì)胞損傷和抗氧化模型比較了這兩

5、種方法獲得的萃取物生物活性的差異。結(jié)果顯示,在濃度為100μg/mL時,靈芝子實(shí)體超臨界 CO2萃取物(SFE-CO2E)對腫瘤細(xì)胞 LNCaP、K562和 HepG2增殖的抑制率分別為78.37%、87.09%、78.85%,結(jié)果均高于靈芝子實(shí)體醇提物(EtOHE)的60.65%、82.29%、66.15%;在體外抗神經(jīng)細(xì)胞損傷的模型中,在濃度為200μg/mL時,SFE-CO2E對PC12細(xì)胞的修復(fù)率為59.29%,優(yōu)于EtOHE的

6、17.77%;然而在清除羥基自由基、H2O2自由基和DPPH自由基的實(shí)驗(yàn)中,在濃度為800μg/mL時, EtOHE對三種自由基的清除率分別為61.90%、67.33%、52.07%,結(jié)果均高于SFE-CO2E的29.24%、39.43%、17.05%。由以上結(jié)果可見,超臨界 CO2萃取法和醇提法在萃取靈芝子實(shí)體中的不同生物活性物質(zhì)方面各有優(yōu)勢。針對中試的試驗(yàn)設(shè)備,我們還設(shè)計(jì)了超臨界 CO2萃法萃取靈芝子實(shí)體三萜的中試萃取工藝,結(jié)果如下

7、:使用夾帶劑泵連續(xù)的加入夾帶劑,靈芝子實(shí)體粒度為40目,夾帶劑即乙醇的濃度為95%,萃取壓力為35 Mpa、萃取溫度為40℃、萃取時間為100min、CO2流量為35 g/min、夾帶劑泵的行程為15mm。在此條件下SFE-CO2萃取靈芝子實(shí)體總?cè)频妮腿÷士蛇_(dá)1.66%。
　　在靈芝子實(shí)體抗前列腺癌活性成分的研究中,我們先用不同的有機(jī)溶劑,按極性從小到大對靈芝子實(shí)體的SFE-CO2E進(jìn)行分部,然后再以抑制前列腺癌細(xì)胞LNCaP增

8、殖的活性為指導(dǎo),對活性部位用硅膠柱層析、凝膠柱層析法等方法進(jìn)行分離純化,最終得到10個化合物,其中乙酸乙酯萃取部分共分離得到4個化合物(化合物1-4),氯仿萃取部分共分離得到了5個化合物(化合物1,2,8,9,10),石油醚萃取部分共分離得到了4個化合物(化合物1,5,6,7)。在這些化合物中只有化合物2有明顯的抑制LNCaP增殖的活性,在作用濃度為100μg/mL時,其對LNCaP細(xì)胞增殖的抑制率可達(dá)50%以上。運(yùn)用現(xiàn)代的光譜技術(shù)(E

9、SIMS、1D NMR、2D NMR等)對獲得的化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,確定化合物1為麥角甾醇和星魚甾醇的混合物,化合物2為靈芝酮三醇,化合物3為靈芝醇 B,化合物5為 ergosta-7,22-diene-3β-yl pentadecanoate,化合物8為ergosta-7,22-diene-2β,3α,9α-triol,化合物9為靈芝醇 A。抗前列腺癌的活性跟蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,靈芝子實(shí)體SFE-CO2E及其分部的各個部分都對LNCaP

10、細(xì)胞的增殖具有抑制作用,且隨著濃度升高其抑制作用也增強(qiáng)。靈芝子實(shí)體 SFE-CO2萃取物對LNCaP細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng),在作用濃度為100μg/mL時,其對LNCaP細(xì)胞增殖的抑制率可達(dá)71.76%。各分部部分對LNCaP細(xì)胞增殖的抑制作用由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯部分>氯仿部分>石油醚部分>正丁醇部分。乙酸乙酯部分、氯仿部分和石油醚部分分離純化所得的各個組份的抗前列腺癌活性跟蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多個組份都具有明顯的抗前列腺癌活性。
　

11、　在靈芝子實(shí)體活性成分的研究過程中我們發(fā)現(xiàn),許多粗分離組分都有很好的抗前列腺癌細(xì)胞增殖的生物活性,然而分離得到的化合物的活性卻不理想,因此我們對靈芝子實(shí)體 SFE-CO2E和四種靈芝三萜類的化合物抗前列腺癌作用的機(jī)理都進(jìn)行了初步的研究。我們運(yùn)用四唑鹽(MTT)比色法、酶聯(lián)免疫(ELISA)法和蛋白質(zhì)印跡法(Western bloting)研究了靈芝子實(shí)體的SFE-CO2E、靈芝醇B、靈芝酮三醇、靈芝酸S和靈芝酸R對雄激素依賴性前列腺癌細(xì)

12、胞株LNCaP細(xì)胞的增殖、分泌前列腺特異性抗原(PSA)和表達(dá)雄激素受體(AR)的抑制作用。另外我們還建立了HPLC法研究活性物質(zhì)對5α-還原酶的抑制作用的體外模型。建立的HPLC法檢測5α-還原酶活性的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ腿缦?色譜分離條件為YMC-Pack ODS-AQ色譜柱(5μm,250 mm×4.6 mm),流動相:甲醇/水=75/25,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為20μL;柱溫為常溫;檢測波長為242 nm,睪酮(T)的出峰

13、時間為8.83 min?？傮w積為200μL的5α-還原酶催化反應(yīng)體系:待測樣品10μL,1 mM的T10μL,0.625 mg/mL大鼠肝微粒體160 mL,6 mM的NADPH20μL,37℃反應(yīng)80 min。反應(yīng)完成后加入400μL甲醇終止反應(yīng),15294 g離心30 min后取上清用0.22μm的膜過濾后上HPLC進(jìn)行分析。HPLC法檢測5α-還原酶活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示靈芝子實(shí)體SFE-CO2E、靈芝酮三醇、靈芝醇B、靈芝酸S和靈芝

14、酸R都對5α-還原酶具有明顯的抑制作用,四種靈芝三萜類化合物對其抑制作用由強(qiáng)到弱依次為靈芝酸 R>靈芝酸 S>靈芝醇B>靈芝酮三醇。MTT法檢測活性物質(zhì)對LNCaP細(xì)胞的增殖的抑制作用的結(jié)果顯示,在有或沒有雄激素睪酮(T)和雙氫睪酮(DHT)存在的條件下,靈芝子實(shí)體 SFE-CO2萃取物、靈芝酮三醇、靈芝酸 S和靈芝酸R都對LNCaP細(xì)胞的增殖有抑制作用且呈現(xiàn)濃度依賴性,但靈芝醇B只在T和DHT存在的條件下才對LNCaP細(xì)胞的增殖有抑制

15、作用且呈現(xiàn)濃度依賴性。ELISA法檢測活性物質(zhì)對 LNCaP細(xì)胞分泌PSA的抑制作用的結(jié)果顯示,靈芝子實(shí)體SFE-CO2萃取物、靈芝酮三醇、靈芝醇B、靈芝酸S和靈芝酸R都對LNCaP細(xì)胞分泌PSA具有明顯的抑制作用,并且在T或DHT存在的條件下,它們對LNCaP細(xì)胞分泌PSA的抑制作用比沒有T或DHT存在時更強(qiáng)。Western bloting的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,靈芝子實(shí)體 SFE-CO2萃取物、靈芝酮三醇、靈芝醇B、靈芝酸S和靈芝酸R都能在