WNT通路抑制因子的甲基化在大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤(LST)中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、目的與意義
　　 大腸側(cè)向發(fā)育性腫瘤是一類主要沿粘膜表面呈側(cè)向淺表擴(kuò)散,具有與其大小不相稱的高惡變潛能的表淺型大腸腫瘤。目前對(duì)該腫瘤的研究還停留在臨床的內(nèi)鏡下診斷及治療方面。
　　 就形態(tài)上而言,早期大腸癌可以被分為兩種,一種是隆起型,另一種是平坦型。但是到目前為止,有關(guān)于平坦型大腸腫瘤的準(zhǔn)確的表觀遺傳方面的變化知之甚少。
　　 越來越多的證據(jù)表明平坦型的大腸癌可以解釋大約10％-20％的大腸癌?，F(xiàn)在仍然存在

2、有關(guān)平坦型與隆起型腫瘤的起源和進(jìn)展的爭(zhēng)論。
　　 Wnt 介導(dǎo)的信號(hào)途徑可受胞外分泌蛋白的調(diào)節(jié).有兩類 Wnt的拮抗物:第一包括分泌的Frizzled 相關(guān)蛋白(sFRP)家族,Wnt 抑制因子-1(WIF-1)和Cerberus,通過直接與 Wnt 分子結(jié)合而抑制 Wnt 信號(hào)傳導(dǎo):第二類包括 DKK 家族,通過與 Wnt受體復(fù)合體 LRP5/L 和LRP6的結(jié)合而抑制 Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)。LRP5/6 和Dkk 低密度脂蛋白的

3、受體相關(guān)蛋白(LRP,low-density lipoprotein-receptor-relatedprotein)是一類在脂代謝中具有重要作用的蛋白家族,其中哺乳動(dòng)物的LRP-5,6 和果蠅中的Arrow 具有高度的同源性,同屬一個(gè)亞家族.新近的研究發(fā)現(xiàn),LRP-5/6 在WNT信號(hào)通路中具有重要的作用.他們的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是,均含有三個(gè)保守的區(qū)域:(1)胞外區(qū),具有表皮生長(zhǎng)因子(EGF,epidermal.growth factor)重

4、復(fù)序列和LDLR(low-density lipoprotein-receptor)重復(fù)序列,(2)跨膜區(qū),(3)胞內(nèi)區(qū).LRP-5/6 胞外區(qū)可以結(jié)合 WNT 蛋白,和Frizzled 受體相互作用將信號(hào)從胞外傳入胞內(nèi)。已有研究結(jié)果表明,胞內(nèi)區(qū)并未見明顯的催化活性的結(jié)構(gòu),在 WNT 信號(hào)存在時(shí),LRP-5 胞內(nèi)區(qū)可以募集 AXIN 并使其降解,從而激活 WNT 通路。Dkk1(dikkopfl)作為WNT胞外的抑制子,正是通過結(jié)合其受

5、體 LRP6 發(fā)揮作用的。
　　 根據(jù) Wnt 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的方式,將Wnt信號(hào)途徑分為經(jīng)典途徑(canonicalWnt signal pathway)和非經(jīng)典的途徑(noncanonical Wnt signal pathway)。經(jīng)典 Wnt/β-catenin 信號(hào)途徑。Wnt 蛋白在胞膜上與一種卷曲蛋白(frizzled,Frz)的跨膜受體相結(jié)合,同時(shí)結(jié)合的還有低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(lowdensity lipop

6、rotein receptor related protein 5 and 6,LRP5/6),這是 Wnt信號(hào)通路活化的重要起始信號(hào)。通過這些受體復(fù)合物將信號(hào)傳至胞質(zhì)內(nèi),激活一系列蛋白的活性,包括散亂蛋白(dishevelled,Dsh)、糖原合成酶激酶(GSK-3β)、APC(andenomatous polyposis coli)、軸蛋白(AXIN)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑 β-catenin。Wnt 和Frz 受體的結(jié)合被 WIF1 和分泌

7、性Frz 相關(guān)蛋白(secretedfrizzled-related proteins,SFRPs)競(jìng)爭(zhēng)性抑制,而 Dickko 家族(DKK-1,DKK-2)通過間接減少可利用的輔助受體LRP的數(shù)量來間接抑制Wnt與膜受體的結(jié)合。
　　 在正常情況下胞質(zhì)內(nèi) β-catenin的水平被多蛋白降解復(fù)合體調(diào)控,這組復(fù)合體包括 APC、AXIN、GSK-3β和酪蛋白激酶 1α/ε(CK1α/ε),復(fù)合體的功能可使 β-catenin

8、磷酸化,而后被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解。所以正常情況下,胞質(zhì)內(nèi)游離 β-catenin 處于極低的水平。一旦 Wnt 蛋白與受體 Frz 結(jié)合,可使胞質(zhì) Dsh 激活而被磷酸化,進(jìn)一步與APC結(jié)合,抑制 GSK-3 β的活性,使 β-catenin不能被磷酸化,導(dǎo)致 β-catenin 在胞質(zhì)內(nèi)積累繼而入胞核,與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子 TCF/LEF(T cell factor/lymphoid enhancer factor)形成復(fù)合體,激活一系

9、列Wnt 信號(hào)靶基因的轉(zhuǎn)錄,包括c-myc、cyclinD1、MMP-7 和免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄因子2(ITF-2)。核內(nèi) β-catenin的出現(xiàn)是Wnt信號(hào)通路激活的標(biāo)志。β-catenin 是Wnt 信號(hào)通路的正向調(diào)節(jié)因子,而 APC,AXIN,GSK-3 β等則是負(fù)向調(diào)節(jié)因子。
　　 非經(jīng)典的Wnt 信號(hào)途徑 Wnt 蛋白與受體的結(jié)合也可以通過其他兩種途徑激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。其一,與某些 Frz 受體的結(jié)合可以使細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放,激

10、活蛋白激酶 C(PKC)。其二,Dsh 激活Jun-N末端激酶(JNK)通路,從而調(diào)控細(xì)胞支架重排以及細(xì)胞的極性。非經(jīng)典的Wnt信號(hào)途徑在腫瘤中的作用尚不明了。
　　 Wnt 信號(hào)途徑的抑制因子在腫瘤的作用越來越受到重視,本研究即著重于Wnt 信號(hào)途徑的抑制因子的甲基化在側(cè)向發(fā)育型腫瘤的研究。
　　 二、方法與內(nèi)容
　　 材料和方法
　　 Wnt 信號(hào)通路在原發(fā)性結(jié)直腸腫瘤中的活性研究。
　　 1

11、、103 例腫瘤標(biāo)本(包括 52 例側(cè)向發(fā)育型腫瘤和51 例隆起型腺瘤)來自南方醫(yī)院消化科 2006年-2009 年內(nèi)鏡切除的標(biāo)本,所有標(biāo)本經(jīng)過福爾馬林固定,石蠟包埋。103 例腺瘤標(biāo)本收集到新鮮腫瘤標(biāo)本的有59例(包括32例側(cè)向發(fā)育型腫瘤和27例隆起型腺瘤),59例腫瘤標(biāo)本中,我們收集到腫瘤組織及腫瘤旁的正常組織,新鮮標(biāo)本立即置入組織保存液(大連寶生物工程有限公司),-80℃低溫冰箱保存。
　　 2、采用半定量 RT-PCR

12、方法,檢測(cè)結(jié)直腸腫瘤組織中 wnt 信號(hào)通路關(guān)鍵分子 SFRP1、SFRP2、SFRP5mRNA的表達(dá)水平。所有標(biāo)本經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄 PCR(reversetranscriptase PCR RT-PCR)用01ympus-CRI(Creative Realities,Inc.)顯微攝像系統(tǒng)拍攝圖片,并用圖像分析軟件 Image Pro plus 6.0分析各圖片累積光密度(integrated optical density,IOD)和陽(yáng)性

13、表達(dá)面積(stained area,SA),計(jì)算平均光密度(Mean density,MD),即 MD=IOD/SA。
　　 3、通過甲基化特異性PCR(methylation specific PCR,MSP)檢檢測(cè)結(jié)直腸腫瘤組織中 wnt 信號(hào)通路關(guān)鍵分子 SFRP1、SFRP2和SFRP5的的甲基化狀態(tài)。亞硫酸氫鹽修飾后的DNA 作為 MSP的模板,采用對(duì)甲基化或非甲基化序列特異的引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠上

14、分離,EB 染色,紫外燈下成像觀察。
　　 4、采用免疫組織化學(xué)方法,檢測(cè)結(jié)直腸腫瘤組織中 SFRP1 蛋白質(zhì)的表達(dá),并采用半定量方法對(duì)組織化學(xué)染色進(jìn)行評(píng)分。
　　 5、去甲基化試驗(yàn) 在結(jié)腸癌 HCT116 細(xì)胞株中進(jìn)行去甲基化試驗(yàn),10 μM 5-氮-2-脫氧胞苷(5-aza-dCyd)去甲基化處理 HCT116 細(xì)胞株 5 天,對(duì)照組僅給予 PBS 處理,同樣條件下培養(yǎng)。每個(gè)細(xì)胞株均進(jìn)行 3 次重復(fù)獨(dú)立試驗(yàn)。觀察去甲

15、基化處理對(duì) HCT116 細(xì)胞株 SFRP1、SFRP2、和SFRP5mRNA表達(dá)的影響。
　　 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 計(jì)量資料以 X±SD 表示,計(jì)數(shù)資料以百分比(％)表示。采用 SPSS13.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,連續(xù)變量?jī)山M間比較采用獨(dú)立 t 檢驗(yàn)或 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。分類變量?jī)山M間比較采用 x 2 檢驗(yàn)或 Fisher 精確概率法,P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)。
　

16、　 三、結(jié)果與分析
　　 結(jié)果
　　 早期 CRC 中存在Wnt信號(hào)通路的sFRP1 過度甲基化。sFRP1、2、5在正常大腸黏膜甲基化率分別為 13.6％(8/59)、28.8％(17/59)、27.1％(16/59)。sFRP1、2、5在LSTs 甲基化率分別為 61.5％(32/52)、65.4％(34/52)、55.8％(29/52)；sFRP1、2、5在PAs 中分別為 39.2％(20/51)、54.9％(

17、28/51)、60.8％(31/51):LSTs和Pas與正常黏膜比較 sFRP1、2、5差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。LSTs 與 PAs 比較,sFRP2、5 沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),sFRP1 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030)。sFRP2、5 mRNA 在 LSTs組和PAs 組中無顯著差異；與 PAs 組相比,LSTs 組 sFRP1 mRNA 水平(t=-3.239,P=0.002)顯著降低。相應(yīng)的,sFRP1

18、 蛋白(Mann-Whitney U 檢驗(yàn),Z=-2.973,P=0.003)在 PAs 組的表達(dá)顯著高于LSTs組；sFRP1蛋白在Pas組常常有陽(yáng)性表達(dá)。
　　 四、結(jié)論
　　 甲基化作用在大腸側(cè)向發(fā)育性腫瘤機(jī)制:LST的病因及病理機(jī)制仍然未完全明確,目前尚未闡明。
　　 1.SFRP1 表達(dá)缺失或下調(diào)可能是大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤的一個(gè)重要特征。
　　 2.SFRP1的甲基化在大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤發(fā)生中起重