脊髓脫細胞支架復(fù)合人臍血間充質(zhì)干細胞促進大鼠脊髓長節(jié)段缺損軸突長入再生及功能恢復(fù).pdf

1、研究背景:
　　 脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)后幾乎無再生能力，導(dǎo)致肢體運動、感覺功能喪失，甚至死亡;SCI對患者生活及社會影響巨大，近年干細胞及組織工程(Tissue Engineering，TE)治療SCI取得一些進展是目前一個研究熱點，但仍然沒有有效的治療方法滿足臨床需要。通常，自然無干預(yù)情況下，損傷脊髓經(jīng)歷了原發(fā)損傷和繼發(fā)損傷的病理過程:①脊髓神經(jīng)元死亡，凋亡

2、和缺乏修復(fù)能力;②促進修復(fù)的因素如神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏，微環(huán)境的變化;③中樞神經(jīng)生長抑制因子的存在;④引導(dǎo)系統(tǒng)退化導(dǎo)致軸突不能沿正確方向生長;⑤損傷部位增殖的成纖維細胞、星型膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和上皮細胞形成神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕，阻礙脊髓再生。而原發(fā)損傷細胞裂解釋放的毒素又可導(dǎo)致繼發(fā)損傷平面上下兩側(cè)的脊髓組織。
　　 鑒于SCI病理的復(fù)雜性，治療策略應(yīng)包括多個因素，聯(lián)合應(yīng)用多種治療措施，不僅保護殘存的神經(jīng)元存活，而且能調(diào)節(jié)損傷脊髓的微環(huán)境，

3、促進軸突再生，重建神經(jīng)反射環(huán)路。SCI目前的治療原理包括:①補充神經(jīng)營養(yǎng)因子促進軸突存活與再生;②中和中樞神經(jīng)生長抑制因子;③減少受損細胞變性和損失;④細胞移植補充受損細胞;⑤減少瘢痕和空洞，提供軸突生長的基質(zhì)。到目前為止，SCI的動物實驗尚沒有滿足臨床治療效果的有效對策。其中主要原因之一是由于傳統(tǒng)的自體移植、同種異體移植或不同的合成支架移植都存在多方面的缺陷，例如:細胞來源受限、細胞功能改造、存在倫理學(xué)問題、免疫排斥反應(yīng)、更重要的是人

4、工支架不能模仿靶組織中細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)三維結(jié)構(gòu)等。更何況再生神經(jīng)軸突通過支架時，容易出現(xiàn)彌散性生長而迷失生長方向。如何才能克服這些神經(jīng)再生的不利因素昵？利用TE技術(shù)（即應(yīng)用細胞、支架和生長因子，以多元聯(lián)合移植的方式修復(fù)和重建受損組織）可能可以幫助損傷脊髓恢復(fù)功能，重建結(jié)構(gòu)。近年的基礎(chǔ)和臨床研究也證實TE技術(shù)可以有效地幫助組織功能恢復(fù)及結(jié)構(gòu)重建。以種子細胞復(fù)合生物支架移植為代表的脊髓修復(fù)研究的

5、進展成為有潛力的SCI修復(fù)策略。
　　 其中，干細胞復(fù)合支架移植是其中研究的熱點，干細胞是具有自我復(fù)制和多向分化潛能的原始細胞，是形成生命機體各種組織器官的起源細胞。在不同微環(huán)境中能夠自我更新及分化或橫向分化為不同類型衍生細胞，可以用來替代病變或衰老的細胞。通常，干細胞分為胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ESC)和成體干細胞。后者可來自骨髓、外周血、臍血(Cord blood，CB)等，它們具有神經(jīng)細胞分化潛

6、能并能分泌生長因子，促使受損神經(jīng)軸突再生通過脊髓內(nèi)空洞損傷區(qū)，并為之提供細胞遷移所必須的有益微環(huán)境或替代受損細胞。其中具有潛力的細胞之一臍血間充質(zhì)干細胞(Cord blood mesenchymal stem cells，CB-MSCs)相比較其他來源的間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有以下明顯的優(yōu)點:①來源豐富，易于獲得;②采集方便，對供者無任何痛苦;③CB中免疫系統(tǒng)處于原始階段，移植后急、慢性

7、移植物抗宿主反應(yīng)(Graft-versus-host reaction，GVHR)發(fā)生率及嚴重程度均輕;④CB中存在較原始的造血干細胞、MSCs以及內(nèi)皮干/祖細胞等，具有更強的增殖、分化能力;⑤CB中各種病毒感染機會相對少。
　　 支架是TE技術(shù)另一個主要方面，理想的支架應(yīng)具有多方面有益特性:仿生三維空間結(jié)構(gòu)和彼此連通的孔隙網(wǎng)絡(luò)，與靶組織相類似的生物力學(xué)性能，良好的生物學(xué)相容性以及對細胞因子傳輸功能等;以促進和引導(dǎo)細胞與組織的再

8、生。近期才有報道的脫細胞脊髓(Acellular Spinal Cord，ASC)支架具備高度仿生特點，相比各種人工支架更復(fù)合脊髓組織特點。有潛力作為脊髓修復(fù)支架:橋接脊髓兩側(cè)殘端、促進宿主神經(jīng)細胞再生、抑制膠質(zhì)癱痕形成;能引導(dǎo)植入種子細胞的增殖、定向分化和遷移;引導(dǎo)神經(jīng)軸突定向延伸、以重建脊髓神經(jīng)環(huán)路、最終促進脊髓神經(jīng)功能的修復(fù)。
　　 尚沒有關(guān)于高度仿生的ASC支架體內(nèi)修復(fù)SCI的報道。我們這項研究利用仿生的大鼠ASC支架復(fù)

9、合人臍血間充質(zhì)干細胞(Human umbilical cordblood-derived mesenchymal stem cells，hUCB-MSCs)異種移植修復(fù)大鼠SCI缺損，觀察療效，并通過組織學(xué)，凋亡，局部免疫狀況探討機制，為將來SCI臨床治療提供基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　 目的:
　　 1.制備大鼠支架，觀測脊髓內(nèi)基質(zhì)骨架的結(jié)構(gòu)特點;體外分離人臍血間充質(zhì)干細胞及擴增鑒定。
　　 2.探索大鼠脫細胞脊髓支架復(fù)

10、合人臍血間充質(zhì)干細胞促進脊髓損傷長節(jié)段軸突長入再生及功能恢復(fù)的效果，探討其機制。
　　 3.探索大鼠脫細胞脊髓支架復(fù)合人臍血間充質(zhì)干細胞修復(fù)脊髓半切缺損相關(guān)局部免疫調(diào)節(jié)及凋亡研究，從凋亡及局部免疫狀況角度探討相關(guān)機制。
　　 第一部分大鼠脊髓脫細胞支架促進大鼠半切脊髓缺損功能恢復(fù)
　　 目的:評價通過凍融萃取法獲得高度仿生的大鼠ASC支架是否具有促進大鼠SCI運動功能恢復(fù)，以及其促進SCI功能恢復(fù)與宿主自體神經(jīng)細

11、胞遷移粘附，增殖分化的關(guān)系。
　　 方法:通過凍融萃取法獲得高度仿生的ASC支架，觀察大體，組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu);隨機選取12只SD大鼠制作脊髓右半切缺損模型，隨機分配到兩個實驗組:A組，SCI組(n=6);B組，SCI+ASC支架組(n=6)。術(shù)后每周運用Basso，Beattie，and Bresnahan locomotor test(BBB)評分進行運動功能評價。分別于術(shù)后2周及8周進行標(biāo)本神經(jīng)細胞免疫熒光染色(Immun

12、ofluorescencestaining，IFS)和髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein，MBP)染色。兩組術(shù)后右下肢功能學(xué)BBB評分采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，比較兩組計量分析行Students，t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果:ASC支架大體觀呈乳白色，缺乏韌性，柔軟;橫截面為ECM構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，充滿空隙，表現(xiàn)為均一，平行排列的淡紅色纖維結(jié)構(gòu);大多

13、數(shù)的細胞，髓鞘和軸突從ASC支架上去除;截面具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu);HE(Hematoxylinand eosin)染色觀察:SCI組，顯示脊髓右半切缺損模型完全破壞毀損脊髓背側(cè)和腹側(cè)右側(cè)部分;SCI+ASC支架移植組:大鼠ASC支架非常好的整合入大鼠脊髓半切缺損，可見大量細胞核分布在ASC支架上;大鼠右后肢運動功能學(xué):SCI+ASC支架移植組顯著促進大鼠脊髓損傷后運動功能的恢復(fù)(P＜0.05);IFS觀察:幾乎沒有星型膠質(zhì)細胞可以在支架上觀

14、察到;有少量神經(jīng)元細胞和神經(jīng)干細胞分布在支架上;而ASC支架植入物的主要分布神經(jīng)細胞類型是少突膠質(zhì)細胞，另外，MBP免疫組化示術(shù)后8周觀察到髓鞘化軸突長入支架。
　　 結(jié)論:大鼠脫細胞脊髓支架是非常具有潛力修復(fù)脊髓損傷的材料，該支架通過改造局部微環(huán)境促進宿主少突膠質(zhì)細胞增殖并促進軸突再髓鞘化。
　　 第二部分脊髓脫細胞支架復(fù)合人臍血間充質(zhì)干細胞促進脊髓損傷長節(jié)段軸突長入再生及功能恢復(fù)
　　 目的:近年來通過干細胞

15、治療SCI取得了一些進展。而最近，具有脊髓修復(fù)潛力高度仿生天然脊髓組織ECM的ASC支架已經(jīng)成功制備。本研究旨在探討脊髓半切缺損損傷的是否可以通過植入高度仿生的ASC支架，及ASC支架復(fù)合hUCB-MSCs種子細胞獲得功能改善及相關(guān)神經(jīng)組織細胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 方法:建立成年SD大鼠(n=36) SCI右半切損傷缺損模型，術(shù)后各組(A組:SCI+ASC支架、(n=12);B組，SCI+ASC+hUCB-MSCs、(n=12);

16、C組:SCI、(n=12))分別立即植入仿生植入物。術(shù)后在每周各組進行大鼠行為學(xué)BBB評分測試，共8周。術(shù)后第二周及第八周進行神經(jīng)細胞標(biāo)志物免疫熒光檢測，并在第八周完成生物素葡聚糖胺(biotinylated dextran amine，BDA)示蹤切片檢查。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗各組大鼠行為學(xué)BBB評分統(tǒng)計差異，方差齊性后各組兩兩比較采用Bonferroni's進行比較，以α=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.

17、05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果:第三代hUCB-MSCs流式細胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)鑒定結(jié)果:該細胞低表達CD14(0.31％)、CD34(0.82％)、CD45(0.23％)、HLA-DR(0.26％)，并高表達以下粘附分子CD90(99.99％)、CD29(92.95％)、CD44(99.98％)、CD105(99.92％)和CD73(99.88％)，鑒定結(jié)果與MSCs的免疫表型相關(guān)報道一致。hUC

18、B-MSCs復(fù)合ASC支架體外培養(yǎng)兩天后大體觀白色，柔軟;5-溴脫氧尿苷(5-bromodeoxyuridine，BRDU)標(biāo)記陽性的hUCB-MSCs分布在ASC支架ECM構(gòu)成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)。術(shù)后大鼠行為學(xué)BBB評分各植入物組相比無植入組具有顯著的運動功能改善(P＜0.01)。行為學(xué)BBB評分兩植入組(A組:SCI+ASC支架;B組，SCI+ASC+hUCB-MSCs)之間除第三周(P＜0.05)外，其余個時間點無顯著性差異(P＞0

19、.05)。BRDU標(biāo)記陽性的hUCB-MSCs在植入后2周尚可觀察到，但未觀察發(fā)現(xiàn)其向神經(jīng)細胞分化。此外，兩植入組（A組:SCI+ASC支架;B組，SCI+ASC+hUCB-MSCs）植入物內(nèi)見大量宿主神經(jīng)細胞（主要是少突膠質(zhì)細胞）。BDA追蹤試驗表明，有再生的宿主軸突生長入植入物，作為一個直接證據(jù)證明軸突再生的效果。掃描電鏡(Scanning electron microscopy，SEM)觀察兩移植物組(A組:SCI+ASC支架;B

20、組，SCI+ASC+hUCB-MSCs)移植物內(nèi)存在較厚的髓鞘及有髓神經(jīng)纖維。
　　 結(jié)論:我們的研究首次提供了實驗證據(jù)表明，大鼠脫細胞脊髓支架與人臍血間充質(zhì)干細胞能夠促進大鼠脊髓損傷軸突再生和功能恢復(fù)。
　　 第三部分大鼠脊髓脫細胞支架復(fù)合人臍血間充質(zhì)干細胞修復(fù)脊髓半切缺損相關(guān)局部免疫調(diào)節(jié)及凋亡研究
　　 目的:制作大鼠脊髓半切模型，觀察ASC支架及其聯(lián)合hUCB-MSCs移植修復(fù)SCI早期，對宿主免疫細胞損傷

21、脊髓局部分布及凋亡的影響，探討移植物恢復(fù)脊髓功能的機制。
　　 方法:按照前兩部分法制作ASC支架，及分離培養(yǎng)hUCB-MSCs;取成年SD大鼠36只，隨機分組:A組:SCI(n=12);B組:SCI+ASC支架(n=12);C組:SCI+ASC+hUCB-MSCs(n=12);大鼠行脊髓半切缺損模型后分別植入相應(yīng)組別植入物，于術(shù)后兩周每組隨機各取6只動物取材做免疫細胞標(biāo)志物IFS及Tunel陽性細胞檢測，高倍鏡下計數(shù)陽性細胞數(shù)

22、量;另每組各取6只動物取材行caspase-3活化度檢測，計數(shù)OD(Optical Density)值。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗各組陽性細胞數(shù)及caspase-3活化OD值的統(tǒng)計差異，方差齊性后各組兩兩比較采用Bonferroni's進行比較，以α=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果:C組(SCI+ASC+hUCB-MSCs)早期術(shù)后兩周，明顯抑制Tunel陽性細胞數(shù)(P＜

23、0.05)及caspase3活化度(P＜0.05)，抑制凋亡;而B組(SCI+ASC)并無抑制凋亡作用。C組(SCI+ASC+hUCB-MSCs)植入脊髓損傷后兩周明顯抑制中性粒細胞(P＜0.05)、巨噬細胞（小膠質(zhì)細胞）(P＜0.05)、T淋巴細胞(P＜0.05)在脊髓損傷區(qū)趨化，增殖;而B組(SCI+ASC)未引發(fā)明顯的免疫細胞局部分布差異，與A組(SCI)相比較，局部炎癥細胞陽性細胞數(shù)量無明顯差異(P＞0.05)。C組(SCI+A