基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2-9在鉛導(dǎo)致腦屏障系統(tǒng)破壞中的機(jī)制研究.pdf

1、鉛是一種在自然界中廣泛存在的重金屬。以往大量研究證實(shí)：鉛在人體的蓄積可以引起鉛中毒，引起包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的全身性毒性。兒童是鉛的易感人群，由于其代謝、發(fā)育等方面的特點(diǎn)，對(duì)鉛的神經(jīng)毒性特別敏感。鉛中毒可造成兒童神經(jīng)系統(tǒng)不可逆損傷，影響智力發(fā)育，損傷認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶功能。所以，兒童鉛中毒一直以來是全世界關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問題之一。
　　大腦屏障由血腦屏障（blood-brain barrier,BBB）、血腦脊液屏障（blood-C

2、SF barrier,BCB）及腦脊液-腦屏障（CSF-brain barrier,CBB）三部分組成。對(duì)于限制血液和大腦組織之間大分子及有害物質(zhì)的通過、維持大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要的作用。鉛對(duì)腦屏障中的毛細(xì)血管具有較高的親和力，可以通過損傷大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，破壞在內(nèi)皮細(xì)胞間形成的緊密連接（tight junction，TJ），從而通過血腦屏障進(jìn)入大腦實(shí)質(zhì)中。本實(shí)驗(yàn)室以往研究發(fā)現(xiàn)：發(fā)育期鉛暴露可以損害大鼠BBB的結(jié)構(gòu)和功能，

3、引起屏障通透性的增加和緊密連接蛋白的表達(dá)水平下降，但其調(diào)控分子機(jī)制尚不完全清楚。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶體中重要的組成部分，其在細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和降解中發(fā)揮著重要的作用。研究顯示MMP-2，MMP-9可以介導(dǎo)claudin-5和occludin這兩種緊密連接蛋白的降解，從而導(dǎo)致血腦屏障的破壞。而MMP-2/9是否在鉛暴露誘導(dǎo)的腦屏障損傷發(fā)揮作用，目前還沒有相關(guān)研究。
　　為進(jìn)一步闡明鉛損傷BBB、B

4、CB通透性的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過建立體外BBB、BCB細(xì)胞模型，觀察鉛暴露對(duì)腦屏障的損傷作用，并研究星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的MMP-2/9在鉛致腦屏障系統(tǒng)損傷和緊密連接蛋白表達(dá)降低中的作用，，為進(jìn)一步闡明鉛誘導(dǎo)腦屏障系統(tǒng)損傷的分子機(jī)制、探討可能的防護(hù)措施提供研究基礎(chǔ)。
　　目的：
　　通過建立體外BBB和BCB模型，觀察鉛體外BBB和BCB模型的通透性、緊密連接蛋白的表達(dá)水平、以及膠質(zhì)細(xì)胞釋放的MMP-2/9水平的影響，明確MMP-2

5、/9在鉛誘導(dǎo)大腦屏障損傷中的作用和可能機(jī)制。
　　方法：
　　1．采用C6細(xì)胞及人大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC），建立合適的BBB體外共培養(yǎng)細(xì)胞系模型；采用Z310細(xì)胞系，建立BCB體外細(xì)胞模型。
　　2．采用跨內(nèi)皮電阻檢測(cè)（TEER法）及葡聚糖法檢測(cè)鉛對(duì) BBB、BCB模型通透性的影響。
　　3．Western blot及免疫熒光法法檢測(cè)屏障中TJPrs表達(dá)及分布情況。
　　4．qRT-PCR、West

6、ern blot法檢測(cè)MMPs mRNA及蛋白表達(dá)。
　　5．明膠酶譜法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中MMPs酶活性。
　　6．采用MMPs組織抑制劑抑制MMPs活性，觀察其對(duì)鉛所致屏障損傷的保護(hù)作用。
　　結(jié)果：
　　1．MMP2/9在血腦屏障中的機(jī)制研究
　　1)膠質(zhì)細(xì)胞C6對(duì)BBB的影響
　　a)HBMEC細(xì)胞加入未經(jīng)Pb處理的C6條件培養(yǎng)液，共培養(yǎng)模型經(jīng)過10μM鉛處理后不會(huì)引起B(yǎng)BB屏障通透性出現(xiàn)大的變化

7、（p>0.05）；且24h的鉛處理后，ZO-1及Occludin兩種緊密連接蛋白的變化也不明顯（p>0.05）。
　　b)HBMEC細(xì)胞在加入Pb處理后C6條件培養(yǎng)液時(shí)，共培養(yǎng)模型經(jīng)過10μM鉛處理后BBB的通透性會(huì)顯著增加（p<0.05）；24h的鉛處理后，ZO-1及Occludin的表達(dá)明顯呈下降趨勢(shì)（p<0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。
　　2)BBB中鉛暴露對(duì)MMP2/9的影響
　　2.5、5、10μM的Pb分

8、別處理12h、24h后，可以使C6膠質(zhì)細(xì)胞中MMP2及MMP9的mRNA水平上表達(dá)上升（p<0.05），且具有劑量依賴效應(yīng)；蛋白表達(dá)增高（p<0.05），使MMP2的酶活性顯著提升（p<0.05），并具有一定的劑量依賴效應(yīng)。
　　3) MMP2抑制劑對(duì)鉛所致BBB損傷的保護(hù)作用
　　C6細(xì)胞加入APR100（MMP2組織特異性抑制劑）后，鉛暴露24h后Zo-1及Occludin兩種緊密連接蛋白的表達(dá)升高（p<0.05），屏障

9、通透性得到了一定恢復(fù)（p<0.05）。
　　2．MMP2/9在血腦脊液屏障中的機(jī)制研究
　　1)鉛暴露對(duì)BCB屏障功能的影響
　　10μM Pb暴露造成BCB模型通透性的改變（p<0.05），并導(dǎo)致ZO-1及Occludin表達(dá)水平降低（p<0.01），表明Pb可以破壞BCB完整性。
　　2)BCB中鉛暴露對(duì)MMP2/9的影響
　　BCB模型中，10μM以下的鉛暴露對(duì)于MMP2/9 mRNA水平及蛋白表達(dá)水

10、平上的改變均不顯著（p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.鉛暴露能夠破壞體外BBB模型的通透性，使TJPrs中ZO-1和Occluudin表達(dá)下降。
　　2.鉛暴露后星型膠質(zhì)細(xì)胞中MMP2及MMP9表達(dá)水平增加，且酶活性升高；抑制MMP2活性，能夠使TJPrs的表達(dá)有所回升，屏障通透性也有一定程度的恢復(fù)。
　　3.鉛能夠破壞體外BCB模型的通透性，抑制緊密連接蛋白的表達(dá)，但MMPs表達(dá)沒有改變，這說明MMPs在鉛