人臍血來源樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)CTL對BGC823腫瘤細(xì)胞的抑制作用.pdf

1、研究背景和目的：
　　 近年來,隨著人口老齡化及人類生存環(huán)境的惡化,惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率均呈現(xiàn)明顯升高的趨勢。目前臨床腫瘤的治療普遍還是采用手術(shù)、放療和化療等傳統(tǒng)方法。但這些方法難以清除體內(nèi)的微小腫瘤病灶且對機體損傷較大,在殺傷癌細(xì)胞的同時,往往也伴隨著正常組織細(xì)胞的損傷。隨著人們對腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的進一步認(rèn)識和腫瘤免疫分子生物學(xué)和生物工程技術(shù)的進展,腫瘤生物治療迅速發(fā)展,成為腫瘤治療的第四種治療模式。樹突狀細(xì)胞(dendr

2、iticcells,DCs)因具有抗原呈遞能力和活化初始T細(xì)胞的能力而成為腫瘤免疫治療的研究熱點。但DCs在腫瘤患者外周血和組織中含量較少,體外擴增也較難達(dá)到理想的治療用劑量。因此,探討從健康產(chǎn)婦臍血分離誘生DCs的方法,研究其體內(nèi)外的抗腫瘤效應(yīng)及機制,有助于為臍血來源的DCs及細(xì)胞毒性T細(xì)胞的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 采集健康足月分娩產(chǎn)婦臍血50-80ml,分離出人臍血單個核細(xì)胞(HumanUmbilic

3、us blood mononuclear cell,HUBMC),將培養(yǎng)瓶靜置2小時,取貼壁生長細(xì)胞,在含15％胎牛血清1640培養(yǎng)液中加入GM-CSF、IL-4和SCF,培養(yǎng)誘生人臍血樹突狀細(xì)胞(Human Umbilicus blood dendritic cell,HUBDC)。取對數(shù)生長期的BGC823腫瘤細(xì)胞,用反復(fù)凍融法取得腫瘤細(xì)胞提取物作為腫瘤抗原,負(fù)載HUBDCs,促使HUBDCs成熟。于普通光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色后的

4、HUBDCs形態(tài),并用流式細(xì)胞儀對其進行表型鑒定。將HUBDCs中的非貼壁細(xì)胞采用尼龍毛柱法分離出T細(xì)胞并鑒定其純度。觀測負(fù)載抗原成熟的HUBDCs對T細(xì)胞的活化增殖能力(混合淋巴細(xì)胞反應(yīng))。采用MTT比色法檢測活化的T細(xì)胞對BGC823靶細(xì)胞的殺傷。動物實驗部分,首先建立荷瘤動物模型,將BGC823細(xì)胞注射于裸鼠并觀察成瘤情況,記錄腫瘤大小。將荷瘤裸鼠隨機分成四組,治療方案如下:A組:體外負(fù)載抗原的HUBDCs和未激活T細(xì)胞；B組:體

5、外經(jīng)HUBDCs誘導(dǎo)活化的特異性T細(xì)胞(CTL)；C組:負(fù)載BGC823抗原的HUBDCs；D組:未經(jīng)HUBDCs致敏的新分離T細(xì)胞。觀察裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長情況并分別記錄。
　　 結(jié)果：
　　 用細(xì)胞因子GM-CSF、SCF和IL-4配伍能誘導(dǎo)人臍血貼壁單個核細(xì)胞向DC分化,加入腫瘤抗原提取物能促使HUBDCs成熟,HE染色光鏡下觀察HUBDCs形態(tài)符合典型毛刺狀、樹枝狀DCs形態(tài),流式分析儀檢測細(xì)胞表型:MHC—Ⅰ、M

6、HC-Ⅱ、CD86(協(xié)同刺激分子)、CD54(黏附分子)、CD11c均較誘導(dǎo)前有顯著升高。其中,CD86表達(dá)率為40.59％±3.27％,CD54為59.21％±6.32％,CD11c表達(dá)率為67.01％±5.17％,MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分別為:42.37％±10.11％和56.31％±6.76％,與誘導(dǎo)前相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.01。同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)顯示:HUBDCs體外可以使抗原特異性T細(xì)胞活化增殖為效應(yīng)T細(xì)胞(cyt

7、otoxicT lymphocytes,CTL),且CTL對靶細(xì)胞BGC823可以產(chǎn)生特異性的抑制及殺傷。在動物實驗中,成功建立人胃癌BGC823荷瘤裸鼠模型。按實驗方案分別對各組治療后,注射負(fù)載抗原HUBDCs+新分離T細(xì)胞的A組和注射特異性CTL的B組都有明顯抑瘤效應(yīng),至30天時A組腫瘤大小為:211mm3B組為:153mm3,B組抑瘤效應(yīng)更加顯著；C組單獨注射負(fù)載抗原的HUBDCs,D組注射未致敏新分離的T細(xì)胞均無明顯抑瘤效果,至