超小超順磁性氧化鐵顆粒標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞的大鼠缺血性腦卒中模型MR活體示蹤研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　腦缺血性疾病是一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病,發(fā)病率、致殘率、死亡率高,僅超急性期溶栓治療效果較確切,但有效治療時間窗很窄(<6h),大多數(shù)患者難以得到及時治療,且溶栓治療有并發(fā)顱內(nèi)出血的危險。腦缺血后新生血管的形成、重塑是功能恢復(fù)和神經(jīng)再生的基礎(chǔ),隨著對血管形成機制的深入研究,“治療性血管新生”的概念為缺血性疾病的治療提供了新思路。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPC

2、s)出生后主要存在于骨髓,在某些情況下可以被動員到外周血,向靶組織歸巢參與生理或/和病理性血管形成。本實驗旨在利用磁共振活體示蹤法并結(jié)合病理學(xué)分析證實骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞能定向遷移到大鼠腦缺血性損傷部位并參與新生血管的形成。
　　材料和方法：
　　SD大鼠,雄性,90g～110g。收集股骨、脛骨和肱骨骨髓液,利用淋巴細(xì)胞分離液分離出單核細(xì)胞,采用貼壁生長法分離、培養(yǎng)細(xì)胞,并用免疫熒光及免疫組化技術(shù)檢測細(xì)胞CD133、CD34

3、及KDR的表達,Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1雙熒光染色鑒定細(xì)胞。以多聚賴氨酸(PLL)為轉(zhuǎn)染劑、用USPIO對培養(yǎng)成功的內(nèi)皮祖細(xì)胞進行磁性標(biāo)記,USPIO濃度為25μg/ml,與PLL最佳比例為1:0.03。雄性SD大鼠20只,250-300g,建立大鼠大腦中動脈阻塞模型(tMCAO),然后將磁性標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞(實驗組)及PBS(對照組)分別經(jīng)鼠尾靜脈移植入tMCAO模型大鼠,于移植前和移植后1d、2d、3d、5d、7d行

4、神經(jīng)功能損傷評分并進行MRI掃描,隨后取腦組織標(biāo)本石蠟包埋行普魯士藍(lán)染色及免疫組織化學(xué)染色檢測CD34、KDR(VEGFR-2)及CD68的表達。測定微血管密度,對神經(jīng)功能損傷評分、梗塞相對體積變化比值和微血管密度行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　成功從大鼠骨髓中分離、培養(yǎng)出內(nèi)皮祖細(xì)胞并鑒定成功。利用USPIO-PLL作為細(xì)胞內(nèi)對比劑可以高效標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞,標(biāo)記率大于98％,細(xì)胞活性無影響。MRI掃描于T2WI及T2*map序

5、列下,腦梗塞區(qū)與正常腦組織交界處可觀察到低信號,T2*map序列下顯示更為明顯。普魯士藍(lán)染色顯示藍(lán)染細(xì)胞位置與磁共振掃描所示低信號位置相對應(yīng)。普魯士藍(lán)染色及免疫組化檢測CD34、VEGFR-2提示磁性標(biāo)記EPCs遷移至腦梗塞區(qū)后參與血管形成并分化成為血管內(nèi)皮細(xì)胞。造模成功7d、9d神經(jīng)功能損傷評分示實驗組大鼠損傷積分低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);細(xì)胞移植7d后兩組間梗塞相對體積變化比值無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);