中藥藥效物質(zhì)乳香酸及鞣花酸“化瘀解毒”治療血瘀證的作用及機(jī)制.pdf

1、中醫(yī)藥的應(yīng)用歷史悠久，一直在重大疾病的防治中發(fā)揮著不可替代的作用，其療效在國(guó)際范圍內(nèi)得到公認(rèn)。中藥的研發(fā)和應(yīng)用在中國(guó)、德國(guó)、日本、印度發(fā)展迅猛，例如復(fù)方丹參滴丸、金納多、小柴胡湯等中藥制劑。近年來，心腦血管疾病嚴(yán)重?fù)p害人們身體健康、影響生活質(zhì)量，致死率逐年升高。腦卒中和動(dòng)脈粥樣硬化是代表性心腦血管疾病，且動(dòng)脈粥樣硬化是腦卒中的重要病理基礎(chǔ)。雖然西方醫(yī)學(xué)針對(duì)這兩類疾病的研究較多，但是目前仍缺少有效的治療方式，針對(duì)疾病單一靶點(diǎn)、單一發(fā)病環(huán)節(jié)

2、的藥物研發(fā)已進(jìn)入了瓶頸期。而中醫(yī)治法治則強(qiáng)調(diào)對(duì)機(jī)體的整體調(diào)控、多靶點(diǎn)多層次防治疾病，這種理念已突顯出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在中醫(yī)藥理論中，腦卒中以及動(dòng)脈粥樣硬化病變病因歸結(jié)于“血瘀”，屬于中醫(yī)血瘀證的范疇。“化瘀解毒”中藥治療血瘀證在臨床上取得了明確的效果，有副作用少、藥物依耐性低等優(yōu)勢(shì)。然而，傳統(tǒng)中藥面臨著諸如成分不明確、機(jī)制不清楚、臨床安全性等問題，這些問題的解決是中醫(yī)藥得到突破性發(fā)展的關(guān)鍵。
　　已有研究證實(shí)，鞣花酸和乳香酸均為“化

3、瘀解毒”中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，兩者均是具有抗氧化活性的天然化合物并且有可能作用于Nrf2通路。乳香酸是“活血定痛”的中藥乳香的主要藥效成分，而鞣花酸廣泛存在于中藥石榴、赤芍、五倍子中。在傳統(tǒng)組方中乳香和包含鞣花酸的中藥常配伍合用。本課題中我們以血瘀證急性分型中的腦卒中和慢性分型中的動(dòng)脈粥樣硬化疾病為研究模型；作用機(jī)制探討以經(jīng)典的抗氧化應(yīng)激通路Nrf2/HO-1為主；在研究AKBA和KBA的神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)中，采用了大鼠腦缺血再灌注模型、

4、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)、細(xì)胞缺氧缺糖（OGD）模型、免疫組織化學(xué)、免疫印跡等技術(shù)。在研究EA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和血管內(nèi)皮功能障礙的作用中，使用了兩種高血脂小鼠模型和HVUECV細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分為以下兩個(gè)部分：
　　第一部分乳香藥效物質(zhì)AKBA和KBA抗腦缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制研究
　　乳香酸 AKBA和KBA均是“化瘀解毒”中藥乳香樹脂提取物中主要的活性成分即藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于典型的五環(huán)三萜類化合物。本部分實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯?/p>

5、AKBA和KBA作為Nrf2誘導(dǎo)劑在腦缺血再灌注（I/R）損傷保護(hù)的作用及其機(jī)制，進(jìn)行了器官、細(xì)胞、分子多層次多維度的研究。
　　在實(shí)驗(yàn)一中，我們首先證實(shí)了AKBA在大鼠體內(nèi)腦I/R的保護(hù)作用。將所有SD大鼠隨機(jī)分為3組：Sham組，Vehicle+I/R組，以及AKBA+I/R組。建立SD大鼠大腦中動(dòng)脈阻閉（MCAO）模型。于腦缺血再灌注48 h時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)價(jià)。而后處死大鼠，取腦對(duì)其TTC染色，計(jì)算腦梗死體積百分

6、率。評(píng)價(jià)腦組織中氧化指標(biāo)及其Nrf2/HO-1的蛋白表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)二體外模型中，我們進(jìn)一步研究AKBA的藥理學(xué)機(jī)制，以大鼠腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞OGD模型模擬體內(nèi)的缺血再灌注過程。以MTT法表征細(xì)胞的存活率。通過siRNA抑制的方法研究Nrf2/HO-1通路在細(xì)胞保護(hù)中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：與損傷組相比，再灌注開始時(shí)間點(diǎn)注射給予AKBA，再灌注48 h時(shí)，可顯著降低腦梗死體積百分率、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡，同時(shí)誘導(dǎo)腦組織中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)（

7、P<0.05）。在OGD模型中，AKBA同樣可以誘導(dǎo)Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)，并且保護(hù)細(xì)胞免受OGD的氧化損傷。AKBA顯著誘導(dǎo)Nrf2-ARE的結(jié)合活性（P<0.05）。然而，Nrf2和HO-1的敲除可以減弱AKBA介導(dǎo)的保護(hù)作用（P<0.05）。這些結(jié)果均表明，AKBA可以通過Nrf2/HO-1通路在腦I/R損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用以及抗氧化應(yīng)激作用。
　　本課題對(duì)乳香的另外一種藥效物質(zhì)乳香酸KBA的腦保護(hù)作用也進(jìn)行了研究。

8、在實(shí)驗(yàn)三中，體內(nèi)研究模型同樣采用的是雄性大鼠MCAO模型。在缺血再灌注1 h后給予KBA，于再灌注48 h后和損傷組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)KBA顯著降低腦梗死體積，同時(shí)改善神經(jīng)功能評(píng)分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)給予大鼠KBA，能夠有效降低MDA水平，同時(shí)改善SOD的活性（P<0.05），以及調(diào)控誘導(dǎo)氧化還原通路Nrf2/HO-1。在原代培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞OGD模型中，我們同樣發(fā)現(xiàn)KBA具有抗氧化的細(xì)胞保護(hù)作用，并且通過siRNA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了Nrf2/HO-

9、1機(jī)制在細(xì)胞保護(hù)中的重要作用。這些發(fā)現(xiàn)支持了KBA通過調(diào)控Nrf2/HO-1通路發(fā)揮抗I/R損傷的保護(hù)作用的結(jié)論。
　　第二部分鞣花酸基于Nrf2/HO-1通路抗動(dòng)脈粥樣硬化及內(nèi)皮功能保護(hù)的作用
　　本部分實(shí)驗(yàn)的目的是探討“化瘀解毒”中藥藥效物質(zhì)之一鞣花酸（EA）在防治內(nèi)皮功能障礙及動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及其維持氧化還原平衡的機(jī)制。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，模型選擇的是WT小鼠和Apoe?/?小鼠的高脂飲食模型進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)分組均為

10、高脂飲食組（HFD）和高脂飲食加EA組（HFD+EA），持續(xù)時(shí)間為14周。各組小鼠的血管進(jìn)行體外器官水平的血管舒張反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)選擇的是HVUECV的HOCl氧化損傷模型，對(duì)EA的抗氧化細(xì)胞保護(hù)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　實(shí)驗(yàn)一結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)給予高脂飲食組相比，EA可以有效緩解動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程（P<0.05）。在體外器官水平的實(shí)驗(yàn)二中，我們發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化模型的血管環(huán)中，EA可以顯著改善內(nèi)皮依賴的血管舒張功能以及緩解HOCl引

11、起的內(nèi)皮功能障礙（P<0.05）。另外，EA也可以顯著改善NO合成酶活性，以及血液抗氧化指標(biāo)和內(nèi)皮功能標(biāo)志物（P<0.05）。Western blot分析結(jié)果顯示，EA可以顯著誘導(dǎo)血管組織中Nrf2和HO-1的表達(dá)（P<0.05）。在實(shí)驗(yàn)二中，我們發(fā)現(xiàn)EA可以保護(hù)來自于WT小鼠的血管免受氧化損傷，但是這種效果在Nrf2?/?小鼠的血管氧化模型中并不存在（P>0.05），提示 Nrf2在EA的抗氧化保護(hù)作用中是關(guān)鍵蛋白。在實(shí)驗(yàn)三體外HVU

12、ECV細(xì)胞模型中，我們發(fā)現(xiàn)EA可以預(yù)防HOCl誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，同時(shí)明顯增強(qiáng)HO-1的表達(dá)（P<0.05）。然而，EA所發(fā)揮的細(xì)胞保護(hù)作用均被Nrf2-siRNA顯著抑制（P<0.05）。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了EA的由Nrf2介導(dǎo)的抗動(dòng)脈粥樣硬化和內(nèi)皮功能改善作用。
　　本課題基于國(guó)科金（No.81373947）分別在兩部分實(shí)驗(yàn)中探索血瘀證治療的潛在藥物、機(jī)制和靶點(diǎn)。以血瘀證為研究模型，以“化瘀解毒”中藥藥效物質(zhì)乳香酸和鞣花酸為工具藥