nAChRsβ1亞基81位氨基酸點突變引起的棉蚜對吡蟲啉的抗性研究.pdf

1、棉蚜Aphis gossypii(Glover)，一種世界性分布的半翅目蚜科蚜屬的多食性昆蟲，發(fā)生數(shù)量大，繁殖速度快，是棉花苗期的重要害蟲之一，在中國各棉區(qū)均有發(fā)生。吡蟲啉，作為第一個商品化的新煙堿類殺蟲劑，對包括棉蚜在內的大多數(shù)刺吸式口器害蟲有良好的防治效果，但由于長期的不科學用藥，害蟲對吡蟲啉的抗性問題越來越嚴重。
　　已有研究表明，昆蟲對吡蟲啉的抗性機制主要是靶標抗性和代謝抗性，而靶標抗性是昆蟲抗藥性的重要機制，尤其與高水平

2、抗性有關。無論是靶標抗性還是代謝抗性，均是由于基因差異造成的。靶標不敏感性是昆蟲抗藥性的重要機制，尤其與高水平抗性有關。本文主要研究靶標抗性方面的內容。已有研究發(fā)現(xiàn)，位于nAChRs亞基上Loop D區(qū)域的81位氨基酸高度保守（大鼠中為77位），能與吡蟲啉的硝基直接作用，并影響與吡蟲啉的結合。我們在室內篩選的高抗吡蟲啉品系棉蚜nAChRs的β1亞基發(fā)現(xiàn)了81位氨基酸從精氨酸到蘇氨酸的點突變，該突變在田間抗吡蟲啉桃蚜和棉蚜體內亦被證實，但

3、該突變導致昆蟲對吡蟲啉產生抗性的分子機制尚不明確。
　　本文利用熒光定量PCR的方法研究了抗性和敏感品系棉蚜體內的nAChRs各亞基的表達量差異;通過免疫共沉淀和免疫印跡分析篩選出了棉蚜體內nAChRs亞基組合情況，然后通過爪蟾卵母細胞表達技術體系，體外重組構建和表達棉蚜的重組雜合nAChRs，進一步應用電壓鉗技術比較了含有點突變和不含點突變的的重組nAChRs對乙酰膽堿和吡蟲啉的結合差異;同源建模構建棉蚜nAChRs亞基的3D模

4、型，通過分子對接分析比較了野生型和突變型棉蚜nAChRs與吡蟲啉的結合能力。具體研究結果如下:
　　利用熒光定量PCR研究了抗性和敏感品系棉蚜nAChRs各亞基的表達量。結果表明，與敏感品系棉蚜相比，抗性品系體內AChRs各亞基的mRNA表達量下降，但表達下降的程度較低。推測在抗性品系棉蚜體內，nAChRs亞基基因的低水平表達可能造成了靶標興奮性突觸后電位的量降低，間接導致棉蚜對吡蟲啉產生抗性。
　　分別以棉蚜nAChRs亞

5、基的胞內大環(huán)區(qū)域Agα1(R348-G441)、Agα2(P359--C445)、Agα3(I350-S451)、Agα4-1(I344-R480)和Agβ1（K349-E441）為模板合成融合蛋白作為抗原制備多克隆抗體。棉蚜頭部膜蛋白用去垢劑提取后，分別用Agβ1的抗體和各α亞基的抗體進行免疫共沉淀試驗，免疫共沉淀的產物通過免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)Agα3和Agβ1在棉蚜體內是互相結合的，因此，Agα3和Agβ1能夠在棉蚜體內組成具有功能活

6、性的異源五聚體型nAChRs。
　　分別將棉蚜nAChRs亞基Agα3（Genbank登錄號EF626657.1）和大鼠(Rattusnorvegicus)β2亞基Rβ2T77（Genbank登錄號L31622）構建到pT7TS表達載體中，利用定點突變技術將大鼠β2亞基77位蘇氨酸對應的堿基序列進行突變，得到了翻譯后77位氨基酸為精氨酸的Rβ2R77。質粒經內切酶線性化后，體外轉錄得到Agα3、Rβ2R77和Rβ2T77的cRNA

7、，將大鼠的兩種β2亞基Rβ2R77和Rβ2T77cRNA分別和棉蚜nAChRsα3亞基cRNA按1∶1的比例注射到第Ⅴ期的爪蟾卵母細胞內進行異源表達，分別得到了棉蚜重組雜合nAChRs，Agα3Rβ2R77（野生型）和Agα3Rβ2T77（突變型）。然后采用電壓鉗分別測定野生型和突變型的棉蚜重組雜合nAChRs對吡蟲啉和乙酰膽堿的劑量反應。結果表明:對于乙酰膽堿，表達有突變型Agα3/Rβ2T77的卵母細胞和野生型Agα1/RRβ2R7

8、7的卵母細胞的最大內向電流(Imax)和EC50沒有明顯差異(p＜0.01);對于吡蟲啉，表達有突變型Agα1/Rβ2T77的卵母細胞對吡蟲啉的的EC50要明顯高于野生型Agα1/Rβ2R77的卵母細胞，但突變型的最大內向電流要小于野生型(p＜0.01)。說明棉蚜nAChRsβ亞基81位氨基酸殘基由精氨酸突變?yōu)樘K氨酸后，能引起nAChRs結合吡蟲啉的能力下降，導致棉蚜對吡蟲啉產生抗性。
　　采用SWISS-MODE1在線服務器，選

9、擇石紋電鰩（Torpedo marmorata）nAChRs蛋白(PDB號:2BG9)的D鏈和C鏈分別作為棉蚜α3和β1兩個亞基分子的模板進行同源建模，利用Autodock4.0軟件分別將吡蟲啉與Agα3/Agβ1R81和Agα3/β1T81進行分子對接。結果表明:Agα3/Agβ1R81（棉蚜β1亞基81位氨基酸為精氨酸R）與吡蟲啉結合時能形成兩個氫鍵，距離分別為1.9(A)和2.1(A);而Agα3/Agβ1T81（棉蚜β1亞基81