胃癌相關(guān)基因GCRG213對胃癌種植瘤的影響及與APE的相關(guān)性.pdf

1、[背景]胃癌相關(guān)基因GCRG213是我們實驗室篩選出的一條在腸型胃癌組織、癌旁和正常組織間差異表達(dá)的新基因，初步研究表明：該基因與人體內(nèi)無嘌呤無嘧啶核酸內(nèi)切酶(apurinic/apyrimidinicendonuclase，APE/Ref-1)序列有61％同源性并且含有其保守的功能位點；用其正、反義克隆及小干擾RNA片段轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞系MKN45細(xì)胞后，能分別增加和減弱細(xì)胞的生長速度和成瘤性。本實驗在此基礎(chǔ)上對GCRG213進(jìn)行進(jìn)一步

2、研究，同時為胃癌的基因治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。利用本實驗室構(gòu)建好的一套胃癌組織芯片，我們還對胃黏膜組織中APE的表達(dá)進(jìn)行了初步分析。 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，腺相關(guān)病毒(AAV)載體成為目前載體工具研究的熱點，同逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體比較，它具有無致病性、無免疫原性、能感染分裂期和非分裂期細(xì)胞、能穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞內(nèi)長期表達(dá)等優(yōu)點，有望成為人體基因治療和基因功能研究最理想的載體工具。 [目的]1.觀察GCRG213正

3、、反義克隆和shRNA干擾片段體內(nèi)轉(zhuǎn)染對裸鼠胃癌種植瘤生長的影響，分析GCRG213功能；2.比較GCRG213和APE蛋白表達(dá)水平，分析兩者是否相關(guān)；3.研究APE在胃癌組織的表達(dá)狀況及與臨床病理因素和胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。 [方法]1.用pAAVHelper-freesystem包裝含GCRG213正、反向DNA片段的腺相關(guān)病毒：設(shè)計針對GCRG213有效讀框(ORF)的特異性引物，并根據(jù)病毒包裝載體上特異性酶切位點，在引物兩

4、端分別引入相應(yīng)內(nèi)切酶識別位點，從pGEM-T質(zhì)粒上擴(kuò)增出GCRG213的DNA片段，按正、反向克隆入包裝載體上，檢測無誤后，同pHelper質(zhì)粒、pRC質(zhì)粒一起用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，分別包裝出含GCRG213正、反向DNA片段的腺相關(guān)病毒。 2.包裝含shRNA干擾片段的腺相關(guān)病毒：從含干擾效率相對較高RNAi片段的IMG-800質(zhì)粒上選擇特異性酶切位點，連同U6啟動子一起切下RNAi片段，插入病毒包裝載體，包裝出

5、含U6啟動子和RNAi片段的腺相關(guān)病毒。 3.用MKN45細(xì)胞接種裸鼠皮下，成瘤后分別用上述病毒行腫瘤局部注射，并設(shè)立空病毒和空白對照，觀察腫瘤生長狀況。處死大鼠后比較各組腫瘤大小，并用RT-PCR檢測腫瘤組織GCRG213mRNA表達(dá)水平。 4.用免疫組化的方法，分別對正常胃黏膜組織(非萎縮性胃炎和萎縮性胃炎)活檢標(biāo)本、胃癌組織手術(shù)標(biāo)本、正常胃黏膜上皮細(xì)胞、胃癌上皮細(xì)胞進(jìn)行GCRG213和APE蛋白表達(dá)的檢測，比較同一

6、組織或細(xì)胞中兩種蛋白的表達(dá)部位、表達(dá)水平，分析兩者的相關(guān)性。 5.對轉(zhuǎn)染了GCRG213正、反向克隆和RNAi片段后GCRG213表達(dá)水平分別增強(qiáng)或減弱的MKN45-213a細(xì)胞、MKN45-213b細(xì)胞和MKN45-213i-2細(xì)胞進(jìn)行APE免疫組化研究，同MKN45細(xì)胞比較，用Image-ProPlus圖象分析軟件檢測四種細(xì)胞中APE蛋白表達(dá)水平，觀察GCRG213表達(dá)變化是否對APE表達(dá)有影響。 6.用本室構(gòu)建好的

7、胃癌組織芯片進(jìn)行APE免疫組化研究，分析不同胃黏膜組織中APE表達(dá)水平和表達(dá)變化的特征及其與胃癌臨床病理因素和胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。 [結(jié)果]1.我們成功包裝出含GCRG213正、反向克隆的腺相關(guān)病毒 rAAV-GCRG213s、rAAV-GCRG213a，病毒滴度為4×1010v.g./ml。通過對病毒載體酶切位點的分析，實現(xiàn)了對病毒載體的改造，構(gòu)建了含U6啟動子和GCRG213-RNAi片段的質(zhì)粒，并包裝出含U6啟動子

8、和GCRG213-RNAi片段的腺相關(guān)病毒rAAV-U6-shRNA，病毒滴度為5×1012v.g./ml，該質(zhì)粒有望用于其他癌基因的體內(nèi)RNAi實驗。 2.用包裝的病毒對裸鼠皮下種植瘤行局部注射后，實現(xiàn)了目的基因和shRNA干擾片段的體內(nèi)表達(dá)。同注射rAAV-GFP腺相關(guān)病毒的空病毒對照組和注射生理鹽水的空白對照組比較：注射正向克隆的腺相關(guān)病毒rAAV-GCRG213s裸鼠腫瘤生長較快，GCRG213mRNA表達(dá)水平較高；注射

9、反向克隆的腺相關(guān)病毒rAAV-GCRG213a和注射含shRNA干擾片段的腺相關(guān)病毒rAAV-U6-shRNA裸鼠腫瘤生長減慢，GCRG213mRNA表達(dá)水平相對較低。 3.在胃黏膜組織中GCRG213著色比較彌散，以胞漿表達(dá)為主，胞膜和間質(zhì)有表達(dá)，胞核著色少見。APE在正常胃黏膜(非萎縮性胃炎和萎縮性胃炎)中主要在胞核表達(dá)，在胃癌組織則在漿核都有表達(dá)，兩者表達(dá)的部位和程度沒有明確的相似性，但在個別APE和GCRG213都有胞漿

10、表達(dá)的胃癌患者中，其非癌組織的胞漿表達(dá)都呈現(xiàn)一種從深層到淺層逐漸減弱的趨勢。 4.APE在HFE-145細(xì)胞中主要是細(xì)胞核陽性表達(dá)，在GES-1細(xì)胞核呈弱陽性表達(dá)，分裂期細(xì)胞核陽性表達(dá)明顯，在SGC-7901細(xì)胞以胞核表達(dá)為主，個別細(xì)胞有胞漿表達(dá)，在MKN45細(xì)胞也主要是核陽性表達(dá)。GCRG213在上述細(xì)胞中仍以胞漿表達(dá)為主，無明顯核表達(dá)。 5.MKN45-213a細(xì)胞、MKN45-213b細(xì)胞、MKN45-213i-2

11、細(xì)胞的APE表達(dá)水平同MKN45細(xì)胞比較，灰度值分別為121.586±8.290、124.783±11.436、127.776±6.036、139.678±10.987，無明顯差異。 6.APE在正常、胃癌和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中均有胞核表達(dá)、胞漿表達(dá)、漿核均表達(dá)三種表達(dá)模式。在正常組織中，胞核陽性率為96.6％，胞漿陽性率為71.8％，漿核均陽性率為71.4％；在胃癌組織中，胞核陽性率為97.1％，胞漿陽性率為21.4％，漿核均陽性

12、為21.4％，；在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中，胞核陽性率為98.9％，胞漿陽性率為10.0％。 胃癌組織同正常組織比較，胞核陽性率變化不明顯，但陽性程度明顯較正常組織低，差異具有顯著性(X2=13.914，P=0.045)，其中有35.9％患者核表達(dá)輕度減弱，11.2％患者核表達(dá)明顯減弱。胞漿表達(dá)在胃癌組織也明顯較正常組織弱，兩者比較差異也具有顯著性(X2=13.524，P=0.035)，其中有42.4％患者漿表達(dá)輕度減弱，21.4％患者漿表

13、達(dá)明顯減弱。 正常組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中細(xì)胞核、細(xì)胞漿APE表達(dá)水平與臨床各病理因素之間沒有明確相關(guān)性，胃癌組織中胞核表達(dá)與腫瘤浸潤深度(P=0.000)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.010)、TNM分期(P=0.000)有明顯相關(guān)，浸潤深度越深、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期越晚，則胞核表達(dá)越弱，胞核表達(dá)還顯示出與性別有一定相關(guān)性，男性表達(dá)水平較女性高(P=0.048)，胞漿表達(dá)水平則與性別無明確相關(guān)性，只顯示與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.017

14、)和TNM分期(P=0.019)有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期較晚的患者胞漿表達(dá)水平較弱。 腫瘤組織同正常組織比較，胞核、胞漿APE表達(dá)減弱水平與臨床各病理因素之間相關(guān)性分析顯示：胞核表達(dá)減弱水平與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有明顯相關(guān)，與性別也有明顯相關(guān)，女性減弱的比率較男性高；胞漿減弱水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期明顯相關(guān)。 APE在正常胃組織、腫瘤組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)狀況及表達(dá)程度的變化與患者預(yù)后未顯示統(tǒng)計學(xué)

15、相關(guān)。 [結(jié)論]1.用腺相關(guān)病毒載體能有效實現(xiàn)目的基因的體內(nèi)正、反義表達(dá)。插入U6啟動子的腺相關(guān)病毒載體能有效實現(xiàn)目的基因的體內(nèi)RNA干擾。 2.GCRG213是一種促癌因子，其表達(dá)水平升高或降低后，能促進(jìn)或抑制胃癌的生長。 3.GCRG213以胞漿表達(dá)為主，APE以胞核表達(dá)為主，胞漿胞核都有表達(dá)。從蛋白表達(dá)水平分析，GCRG213和APE沒有肯定的相關(guān)性。 4.APE在胃黏膜組織中表達(dá)的陽性率極高，胞漿