一個TIGR04312類蛋白Bbrpd1與球孢白僵菌發(fā)育分化及侵染致病的關(guān)系.pdf

1、附著胞形成和穿透昆蟲體壁是球孢白僵菌（Beauveria bassiana）等病原真菌侵染致病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Bbmpk1 MAPK信號途徑是調(diào)控球孢白僵菌附著胞形成和穿透昆蟲體壁的重要途徑，阻斷該信號途徑導(dǎo)致菌株不能形成附著胞，穿透寄主體壁的能力喪失。附著胞形成時期的抑制削減雜交文庫(SSH)篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，31個基因在Bbmpk1信號阻斷突變體中不表達(dá)和顯著下調(diào)(Zhanget al.，2010)。研究這些靶標(biāo)基因與球

2、孢白僵菌侵染致病過程中的作用，對認(rèn)識Bbmpk1調(diào)控病原菌侵染致病的分子機(jī)理具有重要意義。
　　A570克隆是一個在野生菌株附著胞形成時期特異表達(dá)的基因，該基因編碼蛋白與多種真菌的Regulatory P domain-contain protein高度同源，命名為Bbrpd1。新近公布的球孢白僵菌ARSEF2860基因組序列將Bbrpd1編碼蛋白注釋為轉(zhuǎn)錄調(diào)控子(EJP62179.1)。Bbrpd1啟動子序列含有多個氮源調(diào)控元件

3、結(jié)合位點(diǎn)，推測該基因在侵染過程中與氮源利用相關(guān)。王桂江利用基因破壞等方法研究發(fā)現(xiàn)，Bbrpd1依賴氮源影響球孢白僵菌分生孢子產(chǎn)生（王桂江，2011）。本論文在此基礎(chǔ)上，結(jié)合序列分析、表達(dá)以及構(gòu)建超量表達(dá)菌株等方法，進(jìn)一步研究了Bbrpd1與球孢白僵菌發(fā)育分化及侵染致病的關(guān)系。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　Bbrpd1序列分析及表達(dá)特性。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Bbrpd1推測的編碼蛋白在N-末端含有24個氨基酸殘基的信號肽序(1

4、-24 aa)，C-端含有387個氨基酸殘基(74-460)的choice-of-anchor B domain(1.8E-118)，屬于TIGR04312類分泌蛋白，無明顯的亞細(xì)胞定位信號和DNA結(jié)合元件。由此推測，Bbrpd1可能是一個分泌蛋白，并非轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控蛋白。
　　Real-time RT-PCR分析表明，Bbrpd1在分生孢子產(chǎn)生和成熟過程中表達(dá)量隨著時間的延長而呈下降趨勢，而在液體培養(yǎng)過程中隨著培養(yǎng)時間的延長或營

5、養(yǎng)消耗的加劇，表達(dá)水平呈上升趨勢。不同氮源誘導(dǎo)條件下，Bbrpd1表達(dá)受硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。由此推測，Bbrpd1可能參與球孢白僵菌分生孢子產(chǎn)生、營養(yǎng)脅迫或氮源利用等生物學(xué)過程。
　　破壞和超量表達(dá)Bbrpd1影響球孢白僵菌生長發(fā)育。在完全培養(yǎng)基PDA和SDAY、基本培養(yǎng)基CZM（以NO3-1-N為唯一氮源）上，Bbrpd1基因破壞突變體（Δrpd1）菌落生長速率比野生菌株分別降低了8.5％、15.6％和10.3％，而超量

6、表達(dá)轉(zhuǎn)化子Bbrpd1(OE-rpd1)菌株在SDAY、PDA的菌落生長速率比野生菌株分別降低了5.3％、8.1％。在NO2-1-N為唯一氮源的培養(yǎng)基中，Δrpd1和OE-rpd1的生長速率均低于野生菌株，分別比野生菌株降低了9.4％和6.2％。在以(NH4)2SO4(NH4+-N)、蟬蛻(Cuticle)和蛋白胨(Peptone)為唯一氮源的培養(yǎng)條件下，Δrpd1和E-rpd1的生長均比野生菌株快，其中Δrpd1的生長速率分別比野生菌

7、株增加了30.0％、7.0％和11.7％，OE-rpd1的生長速率比野生菌株分別增加了5.9％、4.6％和19.6％。在以Gln為唯一氮源條件下，Δrpd1的生長快于野生菌株(8.1％)，而OE-rpd1的生長卻比野生菌株慢(7.1％)。由此表明，Bbrpd1嚴(yán)格受氮源調(diào)節(jié)，影響球孢白僵菌營養(yǎng)生長。硝酸還原酶活性測定發(fā)現(xiàn)，在以NaNO2(NO2-1-N)為唯一氮源條件下，超量表達(dá)Bbrpd1顯著提高了酶活性，而破壞Bbrpd1則明顯降低

8、了酶活性。由此推測，Bbrpd1影響NO2-1-N的利用可能涉及硝酸還原酶活性的調(diào)節(jié)。
　　Bbrpd1依賴于氮源影響球孢白僵菌分生孢子產(chǎn)生。在完全培養(yǎng)基SDAY和PDA、基本培養(yǎng)基CZM（以NO3-1-N為唯一氮源）以及蛋白胨(peptone)和Gln為唯一氮源的培養(yǎng)上，Δrpd1的分生孢子產(chǎn)量分別比野生菌株提高了0.51、1.32、1.19、0.36和3.84倍，OE-rpd1的產(chǎn)孢量卻比野生菌株降低了0.5、0.49、0.7

9、7、0.88和1.25倍。在以NH4+-N為唯一氮源的培養(yǎng)平板上，Δrpd1和OE-rpd1的分生孢子均高于野生菌株，分別提高了3.95和3.0倍。而在NO2-1-N為唯一氮源的條件下，Δrpd1和OE-rpd1的產(chǎn)孢量均顯著低于野生菌株。由此表明，Bbrpd1依賴于氮源影響球孢白僵菌分生孢子產(chǎn)生。
　　利用Real-time RT-PCR分析了5個產(chǎn)孢相關(guān)基因FlbA、FlbB、FlbC、FlbD和FluG在野生菌株、Δrpd1

10、和OE-rpd1產(chǎn)孢過程中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，5個產(chǎn)孢相關(guān)基因在野生菌株、Δrpd1和OE-rpd1產(chǎn)孢過程中的轉(zhuǎn)錄模式存在明顯差異，且應(yīng)不同氮源條件而變化。推測破壞和超量表達(dá)Bbrpd1影響球孢白僵菌分生孢子產(chǎn)生可能與干擾產(chǎn)孢相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。
　　破壞和超量表達(dá)Bbrpd1影響球孢白僵菌孢子萌發(fā)。分生孢子活力測定表明，破壞Bbrpd1加速了孢子萌發(fā)，萌發(fā)中時(9.4h)比野生型(11.2h)提前了1.8h;而超量表達(dá)Bbr

11、pd1則延遲了孢子萌發(fā)，萌發(fā)中時(12.2h)比野生型(11.2 h)滯后了1h。由此表明，Bbrpd1影響球孢白僵菌分生孢子活性。
　　破壞和超量表達(dá)Bbrpd1影響球孢白僵菌疏水性和附著性。疏水性檢測表明，破壞和超量表達(dá)Bbrpd1均增強(qiáng)了分生孢子的疏水性，分別比野生菌株提高了12％和5％。固體表面附著性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Δrpd1和OE-rpd1分生孢子在親水表面的附著性低于野生菌株，由此表明，Bbrpd1是影響菌株孢壁表特性的