抗氧化劑抑制紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌SKOV-3細(xì)胞核因子活化及其機(jī)理研究.pdf

1、第一部分 紫杉醇誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞核因子活化相關(guān)機(jī)制的研究 目的：探討紫杉醇是否可誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中NF-кB的活化，及紫杉醇誘導(dǎo)NF-кB活化的作用機(jī)制。 方法：不同濃度紫杉醇作用于人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞不同時間后，應(yīng)用Western blot方法分析各組細(xì)胞胞核中P65蛋白表達(dá)及胞漿中IкBα蛋白表達(dá)，RT-PCR方法檢測抗凋亡基因cIAP-1 mRNA的表達(dá)，流式細(xì)胞儀技術(shù)(F

2、CM)檢測各組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的變化，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測不同濃度紫杉醇對SKOV-3細(xì)胞生長抑制率的影響。 結(jié)果： Western blot結(jié)果顯示：對照組細(xì)胞核內(nèi)有少量P65蛋白表達(dá)，紫杉醇作用1h后，胞核P65蛋白表達(dá)明顯增多，并持續(xù)至24h。不同濃度紫杉醇及不同作用時間組之間P65蛋白表達(dá)無明顯差異。對照組胞漿中IкBα蛋白明顯表達(dá)，紫杉醇作用1h后，胞漿IкBα蛋白表達(dá)即明顯減少，3h后消失，不同濃度紫杉

3、醇及不同作用時間組之間IкBα蛋白表達(dá)無明顯差異。RT-PCR結(jié)果顯示：對照組細(xì)胞有少量cLAP-1 mRNA表達(dá)，紫杉醇(10nM)作用后1h-24h，SKOV-3細(xì)胞cIAP-1 mRNA表達(dá)與對照組比較均明顯升高。流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示：紫杉醇可誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞凋亡，10nM、100nM、500nM紫杉醇作用24h后，SKOV-3細(xì)胞的凋亡率分別是3.52％、10.11％、37.05％，與對照組比較均明顯增高，p<0.05

4、。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示：紫杉醇10-500nM作用24h均可影響SKOV-3細(xì)胞周期，使G<,2>/M期的DNA含量百分比較對照組明顯增高。MTT結(jié)果顯示：紫杉醇在濃度范圍10nM-500nM時均明顯抑制SKOV-3細(xì)胞生長，且隨作用時間延長，抑制作用增強(qiáng)，p<0.05；1nM紫杉醇對細(xì)胞生長抑制不明顯。 結(jié)論：紫杉醇可以誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中NF-κB的活化；紫杉醇可以誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞中抗凋亡基因cIA

5、P-1 mRNA表達(dá)；紫杉醇可以誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞凋亡。第二部分 PDTC抑制NF-k B活化增強(qiáng)紫杉醇化療敏感性相關(guān)機(jī)制研究 目的：探討抗氧化劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)對紫杉醇誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中NF-kB活化過程的影響及SKOv-3細(xì)胞對紫杉醇化療敏感性的影響，并研究其作用機(jī)制。 方法：SKO-3細(xì)胞經(jīng)不同濃度PDTC作用不同時間，或

6、PDTC預(yù)處理1h 后再加入紫杉醇作用不同時間，應(yīng)用Western blot方法分別分析各組細(xì)胞胞核中P65蛋白表達(dá)及胞漿中IKBa蛋白表達(dá)，RT-PCR方法檢測抗凋亡基因cIAP-1mRNA的表達(dá)，流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的變化，MTT法檢測PDTC對SKOV-3細(xì)胞生長抑制率的影響。 結(jié)果：Western blot結(jié)果顯示：不同濃度PDTC作用不同時間，SKOV-3細(xì)胞核內(nèi)P65蛋白表達(dá)與對照組比較無明顯

7、變化；5μMPDTC預(yù)作用1h后再加入紫杉醇(10nM)作用lh，紫杉醇誘導(dǎo)的P65蛋白表達(dá)被抑制，IkB a蛋白表達(dá)恢復(fù)，并持續(xù)24h。RT-PCR結(jié)果顯示：PDTC 5μM預(yù)作用lh可以抑制紫杉醇誘導(dǎo)的cIAP-1 mRNA表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示：PDTC可以誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞凋亡，50M、50μM、500μM PDTC作用24h SKOV-3細(xì)胞凋亡率分別為0.64％、13.60％、19.82％，5μM組與對照組比較差

8、異無顯著性，50μM和500μM組與對照組比較明顯升高，P<0.05。聯(lián)合作用組(5μM PDTC作用1h后加入10nM紫杉醇作用24h)凋亡率為12.91％，與單用10nM紫杉醇組比較明顯升局，P<0.05。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示：聯(lián)合應(yīng)用PDTC與10nM紫杉醇亦使G<,2>/M期的DNA含量百分比較對照組明顯增高；不同濃度PDTC作用24h對sKOV-3細(xì)胞周期無明顯影響。MTT結(jié)果顯示：PDTC在濃度范圍10μM500μ

9、M時均明顯抑制SKOV-3細(xì)胞生長，且隨作用時間延長，抑制作用增強(qiáng)，P<0.05； 5μM PDTC對細(xì)胞生長抑制不明顯；PDTC與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞生長抑制率較單用紫杉醇明顯增高。 結(jié)論：PDTC能阻止SKOV-3細(xì)胞中紫杉醇誘導(dǎo)的NF-k B的活化；紫杉醇誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞中NF-kB活化后可能通過促進(jìn)抗凋亡基因cIAP-1 mRNA表達(dá)而發(fā)揮抗凋亡作用，PDTC可以抑制這一過程。PDTC與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用可以增加SK