宏基因組測(cè)序研究介體煙粉虱中的雙生病毒多樣性.pdf

1、粉虱傳雙生病毒(whitefly transmitted geminiviruses，WTGs)屬于雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬，由煙粉虱傳播，危害多種重要經(jīng)濟(jì)作物。了解WTGs種類(lèi)及生物學(xué)特性對(duì)病毒的防治具有積極的意義。本研究從傳毒介體煙粉虱入手，結(jié)合宏基因組測(cè)序和分子生物學(xué)手段研究粉虱傳雙生病毒的種類(lèi)和變異進(jìn)化，以期了解我國(guó)粉虱傳雙生病毒的種群多樣性，為粉虱傳雙生病毒的防治奠定基礎(chǔ)。
　　2011-2015年，我們從云南、廣西

2、、廣東、海南、浙江和山東的多個(gè)地區(qū)共采集23批煙粉虱樣品。從煙粉虱中提取病毒DNA并分為9個(gè)建庫(kù)樣品，利用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行病毒宏基因組測(cè)序。經(jīng)contigs拼接和比對(duì)，9個(gè)建庫(kù)樣品都檢測(cè)到多種粉虱傳雙生病毒。我們對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行PCR驗(yàn)證，共檢測(cè)到18種病毒，8種betasatellites，2種alphasatellites，10種來(lái)源于病毒DNAA的缺陷型小分子和1種來(lái)源于betasatellite的缺陷型小分

3、子。18種病毒中，一個(gè)為雙生病毒新種，暫名為粉虱傳雙生病毒A(Whitefly Transmitted Geminiviruse A，WTGA)，并在中國(guó)首次發(fā)現(xiàn)越南丁香黃脈病毒(Ludwigiayellow vein Vietnamvirus，LuYVVNV)。云南省檢測(cè)到11種病毒，分別為云南賽葵黃脈病毒(Malvastrumyellow vein Yunnan virus，MYVYnV)、中國(guó)番木瓜曲葉病毒(Papayaleaf

4、curl China virus，PaLCuCNV)、甘薯曲葉病毒(Sweet potato leaf curl virus，SPLCV)、LuYVVNV、丁香黃脈病毒(Ludwigiayellow vein virus，LuYVV)、云南煙草曲葉病毒(Tobacco leaf curl Yunnan virus，TbLCYnV)、中國(guó)番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV

5、)、中國(guó)勝紅薊黃脈病毒(Ageratumyellow vein China virus，AYVCNV)、番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curlvirus，TYLCV)、中國(guó)辣椒黃化曲葉病毒(Pepperyellow leaf curl China virus，PepYLCCNV)及病毒新種WTGA;廣西檢測(cè)到9種病毒，分別為PaLCuCNV、AYVCNV、WTGA、MYVYnV、SPLCV、中國(guó)南瓜曲葉病毒(Sq

6、uash leaf curl Chinavirus，SLCCNV)、中國(guó)番茄曲葉病毒(Tomato leaf curl China virus，ToLCCNV)、廣西番茄曲葉病毒(Tomato leaf curl Guangxi virus，ToLCGxV)和霧水葛金色花葉病毒(Pouzolzia golden mosaic virus，PGMV);海南省檢測(cè)到4種病毒，依次為SPLCV、SLCCNV、LuYVVNV和黃花稔曲葉病毒(S

7、ida leaf curl virus，SiLCV);浙江省檢測(cè)4種雙生病毒，分別為T(mén)YLCV、SPLCV、喬治亞甘薯曲葉病毒(Sweetpotato leaf curl Georgia virus，SPLCGV)和河南甘薯曲葉病毒(Sweet potato leaf curlHenan4 virus，SPLCHn4V);山東省檢測(cè)到TYLCV。廣東省的樣品未檢測(cè)到病毒。對(duì)其中13種病毒進(jìn)行變異進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與植物中分離的同種雙生

8、病毒相比，來(lái)源于煙粉虱樣品中的病毒分離物的同源性相對(duì)較高;其病毒序列的變異程度相對(duì)較低，并且兩者的變異位點(diǎn)存在明顯差異;系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，分離自煙粉虱和植物的病毒都依據(jù)地域不同而形成不同的分支。
　　從云南和廣西的煙粉虱樣品中分離到一個(gè)雙生病毒新種，全長(zhǎng)為2744 bp，與印度分離的巴豆黃脈花葉病毒(Crotonyellow vein mosaic virus，CYVMV)同源性最高(87％)，根據(jù)雙生病毒分類(lèi)命名原則，將其暫名

9、為WTGA。WTGA是一個(gè)不含有衛(wèi)星的單組份雙生病毒，推測(cè)其可能是由CYVMV、云南南瓜曲葉病毒(Squash leaf curl Yunnan virus，SLCYnV)、假馬鞭曲葉病毒(Synedrella leaf curlvirus，SyLCV)、煙草曲莖病毒(Tobacco curly shoot virus，TbCSV)和泰國(guó)煙草曲葉病毒(Tobacco leaf curl Thailand virus，TbLCTHV)重組

10、形成的。構(gòu)建了WTGA的侵染性克隆，致病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，WTGA單獨(dú)接種及與衛(wèi)星TYLCCNB或AYVCNB共同接種本氏煙都能產(chǎn)生葉片上卷、皺縮、脈突、褪綠以及植株矮化等病毒癥狀，但與衛(wèi)星共同接種，本氏煙提早3-4天顯癥，且癥狀較重。Southern印跡顯示，WTGA單獨(dú)或與衛(wèi)星共同接種的植株中都能明顯檢測(cè)到WTGA的積累。
　　從云南和海南的樣品中分離到LuYVVNV，全長(zhǎng)2762 bp，與越南分離物的同源性達(dá)到94.2％，這是Lu

11、YVVNV在我國(guó)的首次報(bào)道。LuYVVNV是一個(gè)不含有衛(wèi)星的單組份病毒，具有典型的菜豆金色花葉病毒屬病毒的基因組結(jié)構(gòu)。構(gòu)建了LuYVVNV的侵染性克隆，致病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，LuYVVNV單獨(dú)接種及與衛(wèi)星TYLCCNB或AYVCNB共同接種本氏煙，都能產(chǎn)生葉片下卷，皺縮、黃化以及植株矮化等癥狀，但與衛(wèi)星共同接種時(shí)，本氏煙的病毒癥狀更為嚴(yán)重。Southern印跡顯示，LuYVVNV單獨(dú)或與衛(wèi)星共同接種的植株中都能明顯檢測(cè)到LuYVVNV的積累。