豬博卡病毒類病毒顆粒的表達(dá)以及在流行病學(xué)方面的應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Baculovirus expressing system)，在昆蟲Tn5細(xì)胞中表達(dá)PBoV的主要構(gòu)造蛋白VP2,以期獲得PBoV的類病毒顆粒(PBoV-LPs)。以PBoV-LPs為抗原，建立酶聯(lián)免疫法(ELISA)，檢測(cè)抗-PBoV抗體，進(jìn)而探討PBoV的血清流行病學(xué)的特征。同時(shí)研究PBoV的免疫原性及免疫反應(yīng)性，為PBoV疫苗的研制開發(fā)奠定基礎(chǔ)。也為未知病毒的抗原性的研究建立一套研究體系和研

2、究模型。
　　方法：
　　1.運(yùn)用PCR法，擴(kuò)增PBoV的VP2基因，將VP2基因克隆到TA克隆載體，并進(jìn)行大量擴(kuò)增。
　　2.構(gòu)建VP2基因轉(zhuǎn)移載體pVL1393-VP2,與線性化的桿狀病毒DNA，一起轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9,得到重組桿狀病毒Ac[VP2]。之后，在Sf9細(xì)胞中，使其大量擴(kuò)增。
　　3.將重組桿狀病毒Ac[VP2]，感染BTL-Tn5B1-4(Tn5)細(xì)胞，進(jìn)行蛋白表達(dá)。動(dòng)態(tài)觀察蛋白表達(dá):將細(xì)胞內(nèi)的

3、蛋白、上清中的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬氏亮藍(lán)(Coomassie blue)染色后，觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)，以及培養(yǎng)上清中蛋白的分泌，以確定回收蛋白的時(shí)間。
　　4.收集培養(yǎng)7天后細(xì)胞上清液，離心、4℃重懸過夜后，進(jìn)行CsC1密度梯度離心純化蛋白。用蛋白測(cè)序方法，檢測(cè)蛋白質(zhì)N端氨基酸序列，驗(yàn)證VP2蛋白的準(zhǔn)確性。Uranyl acetate染色后，電鏡下觀察類病毒顆粒。
　　5.將PBoV-LPs免疫家兔，獲取抗PB

4、oV-LPs抗體。利用該抗體和其它病毒顆粒的免疫反應(yīng)，來確認(rèn)PBoV-LPs與HBoVs、以及PCV2-LPs的交叉反應(yīng)性。
　　6.建立抗體檢測(cè)的方法，通過檢測(cè)家豬和野豬血清中抗PBoV IgG抗體，了解PBoV的流行病學(xué)狀況。
　　7.檢測(cè)家豬和野豬血清PBoV的DNA，明確家豬和野豬中流行的PBoV的分子生物學(xué)特征。
　　結(jié)果：
　　1.重組桿狀病毒AC[VP2]感染的Tn5細(xì)胞中，檢出PBoV VP2蛋白

5、，其分子量約為61.5KDa，細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)高峰，在感染后第三天到第五天，之后開始遞減;上清液中的蛋白，在感染后第三天開始檢測(cè)到，之后逐漸增多;感染后第7天，上清液中蛋白量達(dá)到高峰。
　　2.感染后第七天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，CsCl密度梯度離心法純化蛋白。分子量約為61.5KDa的蛋白質(zhì)集中在收集管8,9,10，密度為1.300g/cm3。電鏡下觀察到直徑約為30nm的類病毒顆粒，形狀和原始病毒相似。蛋白質(zhì)序列分析顯示，類病毒顆

6、粒的N端5個(gè)氨基酸序列，與PBoV VP2蛋白的序列完全一致。說明VLPs是由PBoV VP2基因表達(dá)而來，而且PBoV VP2蛋白可以自行裝配成類病毒顆粒(VLPs)。
　　3.為驗(yàn)證病毒顆粒內(nèi)部是否包被了核酸，利用MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit(Roche Applied Science)試劑盒，從類病毒顆粒中提取核酸，然后將提取物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行觀察。結(jié)果

7、顯示顆粒內(nèi)部未檢測(cè)到核酸。
　　4.將病毒顆粒免疫家兔，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，檢測(cè)抗體的效價(jià)。比較免疫前后兔血清中的抗體，免疫前兔血清中未檢出抗體;免疫后的兔血清中，抗PBoV-LPsIgG抗體的滴度高達(dá)1∶409,600，說明PBoV-LPs具有良好的免疫原性。
　　5.PBoV與HBoVs的抗原性比較:通過ELISA法檢測(cè)抗PBoV-LPs抗體與HBoV-LPs、抗HBoV-LPs抗體與PBoV-LPs的交叉反應(yīng)性，來比較

8、PBoV與HBoVs的抗原性的差別。發(fā)現(xiàn)兔抗-PBoV IgG與HBoV1-LPs和HBoV2-LPs均反應(yīng)，但不與HBoV3-LPs和HBoV4-LPs反應(yīng)。而PBoV-LPs，可與兔抗-HBoV1,2,3,4-LPs IgG發(fā)生交叉反應(yīng)，但弱于同源抗原抗體間的反應(yīng)。說明PBoV可與HBoVs之間有相同的抗原決定簇存在。PBoV-LPs不與兔抗-PCV2-LPs IgG反應(yīng)，PCV2-LPs也不與兔抗-PBoV-LPs IgG發(fā)生反應(yīng)

9、，說明PBoV與PCV2抗原性完全不同。
　　6.家豬和野豬的抗PBoV IgG抗體攜帶率:以PBoV-LPs作為抗原進(jìn)行ELISA試驗(yàn)檢測(cè)抗體。檢測(cè)了194份家豬和259份野豬血清，其結(jié)果，家豬血清抗體陽性率高于90.7％(176/194)，野豬血清抗體陽性率平均為59.5％(154/259)，證明PBoV的感染在家豬和野豬中是很普遍的現(xiàn)象。
　　7.PBoV的病毒核酸檢測(cè):利用巢式PCR擴(kuò)增PBoV NS1部分基因，調(diào)查

10、家豬及野豬的病毒攜帶狀況。從259份野豬血清中共檢出7份血清PBoV DNA陽性，其中兵庫縣采集的血清中有4份，茨城縣2份、長(zhǎng)崎縣1份。核苷酸序列分析結(jié)果表明，這7例病毒DNA屬于PBoV G3型基因組，并可以細(xì)分成4個(gè)亞型基因組，有明顯的地域區(qū)別。家豬血清樣本中，并未檢出病毒DNA，其原因在于，90％以上的家豬都已有抗體，病毒已被清除。
　　結(jié)論：
　　1.本課題成功地利用桿狀病毒表達(dá)體系，合成了豬博卡病毒類病毒顆粒(PB

11、oV-LPs)，并完成類病毒顆粒的鑒定，包括蛋白的表達(dá)量、直徑、電鏡形態(tài)、分子量、顆粒密度、和免疫原性等生物學(xué)指標(biāo)。PBoV-LPs豬博卡病毒類病毒顆粒具有天然VP2蛋白的特性及免疫原性，可作為抗原用于抗體的檢測(cè)以及疫苗的研制。
　　2.應(yīng)用純化的PBoV-LPs作抗原，建立了抗體檢測(cè)的ELISA方法。并用此方法對(duì)PBoV的抗原性進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)PBoV可與HBoVs發(fā)生交叉反應(yīng)，PBoV與PCV2的抗原性完全不同。
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