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文檔簡介
1、本論文建立了高效液相色譜法檢測2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸的方法。該方法色譜條件為:Agilent Zorbax SB-Aq色譜柱(5μm,4.6mm×150 mm);流動相為含0.08%三氟乙酸的水溶液;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測器為DAD檢測器,檢測波長236 nm;進樣量:20μL。 在日本學者研究的基礎上有效簡化分離純化步驟,粉碎枸杞干果,浸提后采用FPLC提取到純度較高的AA-2βG。FP
2、LC條件如下:色譜柱:HiPrepTM16/10 QXL;流動相:5%醋酸;流速u:5.0 mL/min;上樣量:10 mL/次;紫外檢測波長λ:254nm。 實驗比較酶的分離純化方法,提取枸杞中可能有糖基轉移活性的酶,進行轉化試驗,經檢測發(fā)現,最終獲得的酶中,無一具有糖苷轉移活性。 從產纖維素酶菌種中篩選到產糖苷轉移酶的菌種,提取粗酶進行轉化,LC/MS檢測轉化液、枸杞提取物和標樣,確定轉化液中含有和標樣相同分子量的物
3、質,枸杞提取物中的主要物質也與標樣分子量一致,三者分子量均為338。通過DPPH自由基清除法發(fā)現,1 min內抗壞血酸清除自由基效果迅速,之后趨勢減緩,此時AA-2βG的清除優(yōu)勢開始顯現,而轉化液中同步合成的相同分子量的AA-6βG不具有抗氧化性的,AA-2βG清除自由基的總量大于抗壞血酸,證實了報道中1分子AA-2βG清除大于1分子自由基的說法。 在此基礎上,對該菌種的發(fā)酵產酶條件進行優(yōu)化,得到以下最佳發(fā)酵條件:稻草粉15.0
4、%,麩皮5.0%,(NH4)2SO40.4%,MgSO40.012%,1倍CMC的吐溫-40,10 mL自來水,pH自然,放入250 mL錐形瓶中,接種量為1 mL培養(yǎng)48 h的種子培養(yǎng)液,32℃下培養(yǎng)4d。對轉化過程中糖基供體濃度、VC濃度、加酶量和轉化時間進行優(yōu)化,初步確立合適的轉化條件為:以濃度為40 mg/mL纖維二糖作為葡萄糖基供體,濃度為40 mg/mL的維生素C作為受體,16 mgmL酶濃度,以pH5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖
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