琥珀酸在大鼠海馬CA1區(qū)對GABA能和Glu能神經(jīng)遞質系統(tǒng)的調制作用.pdf

1、琥珀酸(succinate)，因來自天然經(jīng)典中藥琥珀而得名，是存在于自然界的一種有機酸，具有抗癲癇、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等多種生物活性。琥珀酸也是三羧酸循環(huán)的中間代謝物，其化學結構與腦內神經(jīng)遞質γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)、神經(jīng)調質?；撬嵯嗨?，位于三羧酸循環(huán)及腦內特有的Glu-GABA-琥珀酸代謝旁路的樞紐地位，不僅參與能量代謝，也影響興奮性Glu和抑制性GABA神經(jīng)遞質平衡。GABA、Glu、?；撬峋悄X內活性物質，腦內琥珀酸含量

2、變化直接影響腦能量代謝并與Glu和GABA的轉化有關，本課題組已在點燃動物模型上證明了琥珀酸的中樞抑制活性，結果表明琥珀酸可能是一種天然的內源性神經(jīng)調質(neuromodulator)。點燃(kindling)模型為神經(jīng)生理和藥理學研究、突觸后長期增強(LTP)和腦可塑性提供了一個較理想的動物研究模型，點燃模型可用于癲癇、精神疾病、成癮及記憶機制研究，GABA和Glu是參與點燃的主要神經(jīng)遞質。本實驗室在前期研究中觀察到琥珀酸可抑制腦杏仁

3、核電點燃、化學性PTZ點燃及海馬快速點燃，證明了琥珀酸具有中樞抑制效應，但具體機制尚待闡明。前文報道琥珀酸可延長GABA-A受體拮抗劑苦味毒誘發(fā)小鼠驚厥的潛伏期，說明琥珀酸中樞抑制作用可能與增強GABA-A受體功能有關，但琥珀酸對GABA能和Glu能神經(jīng)遞質系統(tǒng)的調質作用研究未見報道。本文擬在細胞水平證明琥珀酸的神經(jīng)調質作用。本實驗采用紅外可視腦片膜片鉗技術觀察了琥珀酸在大鼠海馬CA1區(qū)對GABA-A受體介導的抑制性突觸后電流(IPSC

4、s)的作用，以及L、N、P等鈣通道亞型的特異性阻斷劑和激動劑、細胞內鈣庫IP3受體的激動劑Thapsigargin、細胞內鈣庫Ryanodine受體的激動劑Ryanodine、蛋白激酶A(PKA)的特異性阻斷劑KT5720、Ca2+和鈣調蛋白依賴的蛋白激酶II(CaM-KII)的特異性阻斷劑KN62、GABA-A受體苯二氮卓(BZ)結合位點的特異性阻斷劑Flumazcnil對此調節(jié)作用的影響；觀察琥珀酸對離子型Glu受體介導的興奮性突觸

5、后電流(EPSCs)的作用；采用傳統(tǒng)全細胞膜片鉗技術，觀察了琥珀酸對Glu及其離子型受體激動劑-AMPA、KA和NMDA誘發(fā)電流的作用；采用傳統(tǒng)全細胞膜片鉗技術和制霉菌素(Nystatin)穿孔膜片鉗技術觀察了琥珀酸對高電壓激活(HVA)和低電壓激活(IVA)鈣電流的作用。初步探討了琥珀酸對GABA能和Glu能神經(jīng)遞質系統(tǒng)的調制作用及作用機制，為琥珀酸調質功能研究提供有價值的理論和實驗依據(jù)。實驗結果表明：1.琥珀酸在大鼠海馬CA1區(qū)能提

6、高GABA-A受體介導的微小抑制性突觸后電流（mIPSCs）和自發(fā)性抑制性突觸后電流(sIPSCs)的頻率，不影響其電流幅度。1μM琥珀酸作用后，mIPSCs的頻率為1.97±0.2.Hz，sIPSCs的頻率為4.76±0.7.Hz，兩者分別與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。2.為探討琥珀酸引起mIPSCs頻率增加的作用機制，本文觀察了N型鈣通道的特異性阻斷劑ω-Cg-GVIA；N型和P/Q鈣通道的特異性阻斷劑ω-Cm-M

7、VIIC;L型鈣通道的特異性激動劑BA.K-8644和阻斷劑Nicardipine對此作用的影響。在ACSF中加入ω-Cg-GVIA后不影響mIPSCs頻率，而ω-Cm-MVIIC降低mIPSCs頻率，BA.K-8644升高mIPSCs頻率，而Nicardipine能完全阻斷BA.K-8644引起的mIPSCs頻率升高。以上所有激動劑和阻斷劑都不影響mIPSCs幅度。當ω-Cg-GVIA、ω-Cm-MVIIC和Nicardipine同時

8、應用時，對琥珀酸引起mIPSCs頻率增加的現(xiàn)象沒有影響。應用細胞內鈣庫IP3受體的激動劑Thapsigargin升高mIPSCs的頻率，而琥珀酸引起mIPSCs頻率增加的現(xiàn)象不再出現(xiàn)。細胞內鈣庫Ryanodine受體的激動劑Ryanodine、PKA的特異性阻斷劑KT5720、Ca2+/CaM-KII的特異性阻斷劑KN62對琥珀酸引起mIPSCs頻率增加的現(xiàn)象均沒有影響。3.琥珀酸能延長mIPSCs和sIPSCs的半衰減時間。1μM琥珀

9、酸作用后，mIPSCs的半衰減時間為8.73±0.5.ms，sIPSCs的半衰減時間為8.14±0.5.ms，兩者分別與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。4.為探討琥珀酸引起mIPSCs半衰減時間延長的作用機制，我們又觀察了BZ結合位點特異性阻斷劑Flumazcnil和Ca2+/CaM-.II的特異性阻斷劑KN62對此作用的影響。以Zolpidem作為陽性對照，Zolpidem明顯延長了mIPSCs的半衰減時間，應用Flum

10、azcnil可完全阻斷Zolpidem引起的mIPSCs半衰減時間的延長，但Flumazcnil不能抑制琥珀酸引起的mIPSCs半衰減時間的延長，Ca2+/CaM-.II的特異性阻斷劑KN62卻能阻斷此現(xiàn)象。5.琥珀酸對微小興奮性突觸后電流(mEPSCs)和自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSCs)的頻率和半衰減時間都無影響，而能降低其電流幅度。6.Glu及其離子型受體激動劑-AMPA、KA和NMDA在大鼠海馬CA1區(qū)均能引出內向電流。琥珀

11、酸可抑制Glu、AMPA和KA誘發(fā)的電流，而對MDDA誘發(fā)的電流無抑制作用。7.不同濃度的琥珀酸對HVA鈣電流的抑制呈濃度依賴性。1μM琥珀酸作用后，HVA鈣電流從581.04±6.1.pA減小到562.74±5.8.pA，兩者相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。琥珀酸對LVA鈣通道電流未見任何影響。上述實驗結果表明：琥珀酸在大鼠海馬CA1區(qū)能增加突觸前GABA釋放；增加氯通道的開放時間或頻率，對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生超極化作用。此作

12、用可能是琥珀酸抗點燃的主要機制之一。電壓依賴性鈣通道，主要是高電壓激活的鈣通道(P/Q和L型鈣通道)影響突觸前GABA釋放，但與琥珀酸增強突觸前GABA的自發(fā)性釋放無關。Ryanodine敏感的細胞內鈣庫、細胞內的PKA和Ca2+/CaM-.II信號通路不影響琥珀酸增強突觸前GABA的自發(fā)性釋放。IP3敏感的細胞內鈣庫Ca2+釋放是琥珀酸增強突觸前GABA釋放的主要因素。與Zolpidem不同，琥珀酸對GABA-A受體的調節(jié)作用不是通過

13、作用于其BZ結合位點實現(xiàn)的；Ca2+/CaM-KII通路的激活是琥珀酸對GABA-A受體功能調節(jié)作用的途徑之一。琥珀酸對突觸前Glu釋放沒有影響，而能降低EPSCs的電流幅度，通過影響突觸后膜受體功能而抑制興奮性突觸活動。琥珀酸在大鼠海馬CA1區(qū)對Glu引起的興奮性突觸后電流有抑制作用，能通過加速離子型Glu受體的AMPA和KA受體亞型的脫敏，降低興奮性反應而發(fā)揮其藥理學作用。琥珀酸還可以通過某種作用機制抑制VGCC的開放，通過減小高電

14、壓激活的鈣電流減小細胞興奮時Ca2+進入細胞的數(shù)量，調節(jié)胞內Ca2+濃度及胞內級聯(lián)反應。綜上所述，琥珀酸在大鼠海馬CA1區(qū)對GABA能和Glu能神經(jīng)遞質系統(tǒng)均有調制作用，其可能通過以Ca2+為核心的調節(jié)機制作用于GABA系統(tǒng)，從而提供了琥珀酸作為腦內神經(jīng)調質的證據(jù)。本實驗對琥珀酸調節(jié)GABA能和Glu能神經(jīng)遞質系統(tǒng)的研究，為琥珀酸作為腦內新型神經(jīng)調質的作用機制研究提供了理論和實驗依據(jù)，為把琥珀酸開發(fā)成一種安全、天然的新型抗神經(jīng)精神藥物提