瀉火補腎湯對腦出血神經(jīng)干細胞移植后免疫排異中IL-2、IL-10表達的影響.pdf

1、研究背景；腦出血后留有不同程度的偏癱、失語等殘疾，致使病人生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSC)的發(fā)現(xiàn)給腦血管疾病的治療帶來新的希望，但由于腦出血后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞發(fā)生的數(shù)目有限，不足以修復(fù)腦出血后神經(jīng)損傷，因此用外源性神經(jīng)干細胞移植治療腦出血有可能取得滿意的效果。然而腦出血后血腦屏障破壞，大量血液細胞侵入腦內(nèi)，其中免疫細胞激活導(dǎo)致細胞因子釋放。這種腦內(nèi)環(huán)境的改變既可促進小膠質(zhì)細胞等細胞表面表達主要組

2、織相容性復(fù)合物(MHC)分子，促進抗原遞呈及識別，也可誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞MHC分子的表達，腦內(nèi)原有的“免疫豁免”環(huán)境發(fā)生了改變，可誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)，加重組織損傷。 根據(jù)免疫反應(yīng)理論，腦出血血腦屏障損傷情況下，用NSC移植治療可能發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)。即以TH1為主，TH2、CTL參與的免疫反應(yīng)。TH1釋放許多細胞因子，如IFN-γ、TNF-α等。IFN-γ作用于內(nèi)皮細胞，選擇性誘導(dǎo)黏附分子VCAM-1的表達，白細胞穿越毛

3、細血管壁，游出至腦組織引起炎癥反應(yīng)。血管內(nèi)皮細胞無論在腦出血的炎癥反應(yīng)或免疫排斥過程中，均起著關(guān)鍵作用。 目的；本研究旨在通過觀察瀉火補腎湯對白介素-2(interleukin2，IL-2)和白介素-10(IL-10)在NSC移植后腦出血大鼠腦內(nèi)及IFN-γ干預(yù)大鼠腦微血管肉皮細胞(rat cerebral microvascular endothelial cells，RCMECs)中的表達的影響，探討瀉火補腎湯在NSC移植免

4、疫反應(yīng)中作用。 方法1．大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、腦出血組、NSC移植組及瀉火補腎湯組，Ⅶ型膠原酶注射復(fù)制腦出血模型，術(shù)后2d進行NSC移植，第4d， 7d分兩批處死，分別用Western blot及ELISA觀察大鼠腦組織及外周血IL-2、IL-10和蛋白表達的變化，周TUNEL觀察細胞凋亡情況。 2．分離原代鼠腦微血管肉皮細胞，隨機分為空白組、IFN-γ刺激組、正常血清對照組、瀉火補腎湯組，IFN-γ干預(yù)4h后分

5、別用正常血清、含瀉火補腎湯血清孵育4h。用RT-PCR及ELISA觀察IL-2、IL-10mRNA和蛋白表達水平，用TUNE觀察細胞凋亡情況。 結(jié)果 體內(nèi)實驗 1．腦出血進行側(cè)腦室下區(qū)神經(jīng)干細胞移植治療的最佳治療時間是出血后第2天。 2．在正常鼠腦中，未見TUNEL陽性細胞。腦出血后可見較多TUNEL陽性細胞，主要分布于出血區(qū)周圍，NSC移植后4天、7天TUNEL陽性細胞表達增加，與腦出血組比較差異顯著(

6、P<0.05)；瀉火補腎湯干預(yù)后陽性細胞較NSC移植組明顯減少(P<0.05)，神經(jīng)干細胞移植后各組7d較4d細胞凋亡減少。 3．IL-2的檢測： (1)ELISA檢測血清中IL-2蛋白表達：4天時，正常組、假手術(shù)組血清IL-2有輕度表達，腦出血組、NSC移植組血清IL．2水平較正常組和假手術(shù)組明顯上升，瀉火補腎湯組血清IL-2水平低于腦出血組及NSC移植紐；7天時，腦出血組、NSC移植組、瀉火補腎湯血清IL-2水平較4

7、d表達減少，NSC移植組IL-2表達水平最高，瀉火補腎湯組血清IL-2水平低于腦出血組及NSC移植組。 (2)Western bolt檢測腦內(nèi)IL-2蛋白表達：4天時，正常組、假手術(shù)組IL-2有輕度表達，腦出血組、NSC移植組、瀉火補腎湯組IL-2水平較正常組和假手術(shù)組明顯上升，NSC移植組表達最強，瀉火補腎湯組IL-2表達較NSC移植紐減少；7天時各組表達差異比較同4天，各組與4天比較表達減輕，但無統(tǒng)計學(xué)差異。 4．IL-10

8、的檢測： (1)ELISA測血清中IL-10蛋白表達：4天時，正常組、假手術(shù)組血清檢測到較高水平的1L-10表達；腦出血組、NSC移植組、瀉火補腎湯組大鼠IL-10較正常組、假手術(shù)組IL-10表達顯著降低，瀉火補腎湯組較腦出血組IL-10表達增加；7天時腦出血組、NSC移植紐、瀉火補腎湯組大鼠IL-10較乏正常組、假手術(shù)組IL-10表達減輕，三組間沒有顯著性差異(2)Western bolt檢測腦內(nèi)IL-10蛋白表達情況：4天時

9、，正常組、假手術(shù)組IL-10有輕度表達，腦出血組、NSC移植組、瀉火補腎湯組IL-10水平較正常組和假手術(shù)組明顯上升，NSC移植組表達最弱，瀉火補腎湯組IL-10表達NSC移植組明顯增加；7天時腦出血組與NSC移植組、瀉火補腎湯組比較已沒有統(tǒng)計學(xué)差異。而瀉火補腎湯組IL-10表達仍明顯強于NSC移植組。 體外實驗： 1．IFN-γ刺激腦微血管肉皮細胞模擬免疫損傷模型，確定IFN-γ刺激濃度最佳為40ng/ml，5％瀉火補

10、腎湯血清作用4h作為最佳的干預(yù)條件。 2．IL-2的檢測： (1)ELISA檢測細胞上清中IL-2蛋白表達：IFN-γ刺激后，IFN-γ，組、正常血清組、瀉火補腎湯組細胞上清IL-2較空白對照組表達增加，瀉火補腎湯干預(yù)后與IFN-γ組、正常血清組比較IL-2表達減少。 (2)RT-PCR檢測結(jié)果顯示：IL-2：空白組大鼠腦微血管內(nèi)皮細IL-2mRNA表達；IFN-γ干預(yù)后，IL-2mRNA表達顯著增加；正常血清組

11、較IFN-γ刺激紐顯著減少；瀉火補腎湯血清孵育后IL-2mRNA表達較正常血清組明顯降低。 3．IL-10的檢測： (1)ELISA檢測細胞上清中IL-10蛋白表達：IFN-γ刺激后，IFN-γ刺激組、正常血清組、瀉火補腎湯組細胞上清IL-10較空白對照組表達減少，瀉火補腎湯干預(yù)后能上調(diào)IL-10的表達，與IFN-γ刺激組、正常血清組比較IL-2表達增加。 (2)RT．PCR空白組大鼠腦微血管肉皮細胞有IL-10

12、mRNA表達；IFN-γ干預(yù)后，IL-10mRNA表達降低；正常血清組較IFN-γ刺激組表達增加;瀉火補腎湯組IL-10mRNA表達較正常血清組明顯增加。 4．TUNEL檢測：NF-γ干預(yù)后腦微血管內(nèi)皮細胞可見大量TUNEL陽性細胞，瀉火補腎湯組與正常血清組、IFN-γ干預(yù)組比較TUNEL細胞陽性細胞數(shù)顯著減少。 結(jié)論 1．出血大鼠神經(jīng)干細胞移植后IL-2表達上調(diào)，IL-10表達下調(diào)，細胞凋亡增加。瀉火補腎湯能下