高膽固醇血癥兔SO細(xì)胞BK-,Ca-通道β1亞基基因表達(dá)變化及該基因的克隆分析.pdf

1、Oddi括約?。╯phincter of Oddi，SO）是包繞于膽管末端，具有自主舒縮功能的平滑肌結(jié)構(gòu)，對(duì)控制膽汁流入十二指腸起到重要作用。已經(jīng)證實(shí)膽固醇代謝紊亂是膽囊膽固醇結(jié)石形成的重要因素之一，而膽汁中過飽和的膽固醇結(jié)晶析出并形成結(jié)石的先決條件是膽囊排空功能障礙和膽汁的淤積。我們前期的研究結(jié)果證實(shí)，高膽固醇飲食飼喂新西蘭兔可導(dǎo)致SO 舒張功能受損，即高膽固醇血癥（hypercholesterolemia，HC）可誘發(fā)SO功能紊亂（

2、sphincterof Oddi dysfunction，SOD），繼而導(dǎo)致膽囊淤膽，為膽囊內(nèi)膽固醇結(jié)晶的析出提供了適宜的內(nèi)環(huán)境；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HC 兔SO 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（[Ca2+]I）過載可能是SOD發(fā)生的重要原因之一，而HC兔SO細(xì)胞[Ca2+]I 過載與細(xì)胞膜大電導(dǎo)鈣敏感性鉀離子通道（large conductance Ca2+-sensitive K+ channels，BKCa）的功能狀態(tài)密切相關(guān)。但具體的機(jī)制尚不清楚。

3、 BKCa通道在控制平滑肌張力及興奮性方面起著重要作用，它是由結(jié)構(gòu)性α亞基和調(diào)節(jié)性β1亞基共同組成的跨膜蛋白，其功能狀態(tài)與α亞基和β1亞基表達(dá)水平密切相關(guān)。我們前期的研究已經(jīng)證實(shí)HC兔SO細(xì)胞BKCa通道α亞基的表達(dá)量未見異常，由于β1亞基是BKCa通道的調(diào)節(jié)亞基，對(duì)于提高BKCa通道的Ca2+敏感性起到至關(guān)重要的作用，為此本課題第一部分內(nèi)容采用RT-PCR 和Western blot 技術(shù)觀察兔SO細(xì)胞BKCa通道β1亞基（

4、BK-β1）基因在mRNA水平及蛋白水平的表達(dá)情況，進(jìn)而采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察HC兔SO細(xì)胞BKCa 通道功能變化及對(duì)L型電壓依賴性鈣通道（L-type voltagedependent Ca2+ channels, L-VDCC）活性的影響。為了深入探討兔SO細(xì)胞BK-β1基因的結(jié)構(gòu)、功能以及表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而為分析BKCa通道功能與通道基因表型關(guān)系奠定基礎(chǔ)，本課題第二部分內(nèi)容目標(biāo)是克隆并分析兔BKCa通道β1亞基（BK-β1）基因組及

5、其啟動(dòng)子序列。本研究的主要結(jié)果如下： 1. 高膽固醇血癥兔SO細(xì)胞BK-β1基因表達(dá)變化及對(duì)BKCa通道功能的影響 RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，HC兔SO細(xì)胞BK-β1基因在mRNA水平及蛋白水平表達(dá)量明顯下調(diào)。全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HC兔SO細(xì)胞總K+電流密度明顯降低（P < 0.05），BKCa 通道K+電流密度顯著降低（P <0.05），同時(shí)KV通道K+電流密度也顯著降低（P < 0.05

6、），SO細(xì)胞的靜息膜電位呈去極化改變，膜電容呈降低改變。與對(duì)照組相比，HC兔SO細(xì)胞L-VDCC鈣電流密度明顯升高（P < 0.05），但兩組的穩(wěn)態(tài)激活曲線、穩(wěn)態(tài)失活曲線等通道動(dòng)力學(xué)特征均無顯著性改變。我們推測(cè)HC兔SO細(xì)胞BK-β1基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致BKCa通道功能降低，進(jìn)而引發(fā)L-VDCC活性上調(diào)，這可能是HC誘發(fā)SOD的重要原因之一。 2. 兔BKCa通道β1亞基基因的克隆及特征分析 采用3'及5'-cDNA末端

7、快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)從兔SO組織擴(kuò)增BK-β1基因全長cDNA序列（GenBank no. DQ821756），該基因cDNA全長為1408bp，由四個(gè)外顯子組成，開放讀窗（ORF）長度為576bp，編碼191個(gè)氨基酸，其中第一外顯子不編碼；第二外顯子包含24bp非編碼區(qū)（UTR）并編碼1-44個(gè)氨基酸；第三外顯子編碼45-102個(gè)氨基酸；第四外顯子編碼剩余的氨基酸（103-191）。 應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)觀察BK-

8、β1基因在兔SO、主動(dòng)脈、肝臟、心肌、肺臟、骨骼肌、腎臟和腦組織中的分布，結(jié)果顯示該基因在SO和主動(dòng)脈等平滑肌組織中高表達(dá)，在心肌、骨骼肌以及腦組織的表達(dá)量明顯低于平滑肌組織，在肝臟、肺臟和腎臟組織中未見表達(dá)。 采用LA-PCR方法擴(kuò)增BK-β1基因內(nèi)含子序列，三個(gè)內(nèi)含子的長度分別為：第一內(nèi)含子（intron 1）3175bp；第二內(nèi)含子（intron 2）1442bp；第三內(nèi)含子（intron 3）1704bp。結(jié)合該基因的c

9、DNA序列，BK-β1基因組長度為7729bp，包含四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子，外顯子/內(nèi)含子接頭序列均符合GT/AG的經(jīng)典接頭結(jié)構(gòu)。Southern blot分析顯示該基因在兔基因組中為單拷貝基因。 生物信息學(xué)分析表明兔BK-β1 基因編碼的蛋白由兩個(gè)跨膜螺旋和一段長的膜外段組成，具有4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，含有1個(gè)PKA 磷酸化位點(diǎn)及2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。序列同源比對(duì)顯示兔BK-β1基因在種屬間具有很高的一致性。 3. 兔BK

10、Ca通道β1亞基基因啟動(dòng)子的克隆及特征分析 采用熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR)方法，我們首次擴(kuò)增了2021bp兔BK-β1基因上游側(cè)翼序列，并提交到GenBanK（GenBank no. DQ839485）。在線生物信息學(xué)軟件TESS分析顯示，該區(qū)域缺乏典型的TATA-box和CAAT-box，但具有包括GC-box在內(nèi)的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。采用5′-

11、RACE 方法確定該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（+1G），位于翻譯起始位點(diǎn)（ATG）上游447bp處。以擴(kuò)增的5′上游側(cè)翼序列為模板，通過PCR方法構(gòu)建不同長達(dá)的截短體，連入pGL3-basic報(bào)告基因載體中，得到一系列融合構(gòu)建體（P-2001，P-763，P-271，P-93 和P-34），瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎293（HEK293）細(xì)胞，熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示除了截短體P-34（-34/+30），其他截短體都具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。P-763（-763/+

12、30）的熒光素酶活性較空載體高出40倍；P-93（-93/+30）相比P-34（-34/+30）表現(xiàn)出最大的熒光素酶活性差別，P-34的熒光素酶活性僅占P-93的25％。這說明P-93可能為最小的啟動(dòng)子活性區(qū)域，并且在-93/-34區(qū)域的GC-box可能對(duì)轉(zhuǎn)錄起始起著重要作用。 總之，本課題研究內(nèi)容分為兩部分。第一部分研究結(jié)果顯示HC兔SO細(xì)胞BK-β1基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致BKCa通道功能降低，細(xì)胞膜處于去極化狀態(tài)，致使L-VD

13、CC關(guān)閉不全，細(xì)胞外Ca2+持續(xù)內(nèi)流，這可能是導(dǎo)致SO細(xì)胞[Ca2+]I過載的重要原因之一。在第二部分內(nèi)容中，我們首次從兔SO細(xì)胞擴(kuò)增出BK-β1基因（GenBank accession nos. DQ821756 and DQ839485）及其啟動(dòng)子序列。該基因主要分布于平滑肌組織，為單拷貝基因，長度為7729bp，編碼191個(gè)氨基酸，由四個(gè)外顯子及三個(gè)內(nèi)含子組成，與其他哺乳動(dòng)物的該基因有很高的同源性。對(duì)于該基因啟動(dòng)子區(qū)域的分析表明該