原癌基因BCL11A在非小細(xì)胞肺癌中的異常表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　 肺癌居我國(guó)惡性腫瘤死因首位,可分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)兩大類,其中非小細(xì)胞肺癌約占80％以上。盡管肺癌的早期診斷和規(guī)范化治療都取得了一定的進(jìn)步,但只有15-25％的非小細(xì)胞肺癌有手術(shù)治療的機(jī)會(huì),而即使接受根治性手術(shù)治療,仍然有50％的NSCLC患者會(huì)復(fù)發(fā)。傳統(tǒng)的多學(xué)科綜合治療(手術(shù),放

2、療和化療)在提高非小細(xì)胞肺癌的五年生存率方面已經(jīng)出現(xiàn)了“天花板效應(yīng)”[1]。隨著近幾年轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的出現(xiàn),將肺癌基礎(chǔ)研究的結(jié)果向臨床診療轉(zhuǎn)化,開(kāi)發(fā)了一些靶向治療藥物,取得一些令人鼓舞的結(jié)果。EGFR突變及其分子構(gòu)象改變與靶向抑制劑的關(guān)系即是近年來(lái)在肺癌轉(zhuǎn)化研究方面突出的例子[2]。對(duì)于EGFR敏感突變的特定人群,酪氨酸蛋白激酶抑制劑吉非替尼和厄洛替尼能明顯延長(zhǎng)晚期NSCLC患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期[3,4]。但這些治療手段最終都會(huì)出現(xiàn)耐藥,導(dǎo)致治

3、療失敗,歸根結(jié)底是由于對(duì)NSCLC的疾病機(jī)制不清楚。非小細(xì)胞肺癌是一種異質(zhì)性疾病,肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在多層次的基因表達(dá)調(diào)控異常[1],包括基因組DNA水平多種基因的體細(xì)胞遺傳變異、轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)異常及轉(zhuǎn)錄本剪切異常[5]、microRNA 表達(dá)調(diào)控異常[6],進(jìn)而表現(xiàn)為蛋白質(zhì)水平的功能異常。越來(lái)越多的分子表達(dá)調(diào)控異常與腫瘤特定的細(xì)胞周期、生長(zhǎng)分化、細(xì)胞移動(dòng)、凋亡調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程改變相關(guān)[7]。闡明具有驅(qū)動(dòng)作用的特定基因表達(dá)調(diào)控變異機(jī)

4、制有助于闡明腫瘤特定階段生物學(xué)行為,并有助于針對(duì)變異靶點(diǎn)進(jìn)行臨床干預(yù)。
　　 原癌基因活化是許多惡性腫瘤包括肺癌發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制,正常情況下,原癌基因編碼一些生長(zhǎng)因子和受體,通過(guò)嚴(yán)密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),控制機(jī)體正常的生長(zhǎng)與凋亡[8]。多種機(jī)制包括點(diǎn)突變[9]、基因融合與易位[10]、基因擴(kuò)增等[11]都能導(dǎo)致原癌基因異?；罨?使細(xì)胞獲得超常的增殖能力和存活能力,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。大量的分子遺傳學(xué)研究已經(jīng)顯示在肺癌中主要有以下染色體片

5、段存在擴(kuò)增,包括1p(NRAS,MYCL1,PAX7)、3q(EIF4G1,TP73L,PIK3CA)、5p(SKP2)、7p(EGFR)、8q(PTK2、MYC)、11q(CCND1、BIRC2、BIRC3)和20q(E2F1)[12]。另外,如EGFR和KRAS的點(diǎn)突變、EML4-ALK融合基因[13]與肺癌發(fā)生的關(guān)系也已經(jīng)得到證實(shí)。與抑癌基因不同的是,癌基因發(fā)揮功能是顯性作用的,即一對(duì)等位基因其中的一個(gè)基因存在活化,就能發(fā)揮惡性轉(zhuǎn)

6、化細(xì)胞的功能。但是,這些經(jīng)典的遺傳學(xué)并不能解釋所有的現(xiàn)象,近幾年來(lái)興起的表觀遺傳學(xué)讓我們對(duì)非小細(xì)胞肺癌有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí),如p16基因甲基化與鱗癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系,Bhutani等人還發(fā)現(xiàn)p16基因甲基化與早期肺癌的預(yù)后相關(guān),這些可遺傳的基因異常并不是由于DNA序列本身發(fā)生任何改變[14,15]。常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)修飾包括甲基化,組蛋白乙?；?近幾年來(lái),科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種新的表觀遺傳學(xué)修飾-microRNA調(diào)控,在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著

7、重要的作用[16]。
　　 微小RNA(microRNA,miRNA)分子是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控蛋白翻譯功能的內(nèi)源性非編碼RNA分子,長(zhǎng)約22nt。最早microRNA是由Lee等在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Lin-4[17],目前在包括人類、果蠅等多個(gè)物種鑒別出數(shù)千個(gè)microRNAs(詳見(jiàn)microma.sanger.ac.uk)。成熟的microRNA可通過(guò)互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)的方式與mRNA相應(yīng)的區(qū)域結(jié)合,從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯,在轉(zhuǎn)錄后

8、水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。多種microRNA已被證實(shí)參與白血病、淋巴瘤、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生[18-20]。MicroRNA參與腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜多樣,microRNA異常表達(dá)可能上調(diào)原癌基因或下調(diào)抑癌基因,也可能因自身突變或拷貝數(shù)擴(kuò)增導(dǎo)致調(diào)控功能異常。從microRNA水平探索腫瘤的異常翻譯后調(diào)控機(jī)制正成為腫瘤分子遺傳學(xué)的新的研究熱點(diǎn)。
　　 在肺癌研究中,已發(fā)現(xiàn)多個(gè)microRNA分子與肺癌相關(guān)。Takamizawa等

9、首次發(fā)現(xiàn)了let-7在肺癌中低表達(dá),并且低表達(dá)的患者預(yù)后較差[21]。Johnson等確定Ras受let-7家族的調(diào)控,其中包括線蟲(chóng)的RAS基因、人的KRAS、HRAS和NRAS基因,且let-7表達(dá)量與生存預(yù)后相關(guān),體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了過(guò)量表達(dá)let-7可抑制肺癌生長(zhǎng)[22,23]。miR-128可直接調(diào)節(jié)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的水平,并與靶向藥物EGFR TKI(Gefitinib)療效相關(guān)[24]。隨著研究進(jìn)展,越來(lái)越多的mic

10、roRNA分子被發(fā)現(xiàn)與肺癌發(fā)生及預(yù)后等相關(guān)。盡管肺癌相關(guān)microRNA資料越來(lái)越多,但多數(shù)microRNA異常調(diào)控的下游分子機(jī)制不清楚。
　　 如何確定microRNA調(diào)節(jié)的靶基因、并將microRNA表達(dá)變異與特定的基因表達(dá)水平變化有機(jī)的聯(lián)系起來(lái)并加以驗(yàn)證是基因表達(dá)調(diào)控研究中新的課題,也是生命科學(xué)研究中一項(xiàng)繁重的任務(wù)。
　　 研究目的：
　　 本研究通過(guò)高通量的芯片技術(shù)篩選非小細(xì)胞肺癌與癌旁組織中差異表達(dá)的基

11、因,找到一種差異表達(dá)的基因BCL11A。接著用實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和免疫組織化學(xué)技術(shù)分別在基因水平和蛋白水平驗(yàn)證芯片的結(jié)果,并將BCL11A表達(dá)水平與臨床病理資料進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,以探明其在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生,發(fā)展中的作用。最后從基因拷貝數(shù)變化和microRNA調(diào)控兩方面探討其異常表達(dá)的機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
　　 1.我們選取2003-2006年在廣東省肺癌研究所接受根治性手術(shù)治療的114例非小細(xì)胞肺癌患者和其中53例癌旁

12、肺組織,應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析非小細(xì)胞肺癌與癌旁組織之間的基因表達(dá)差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)一種原癌基因BCL11A在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。
　　 2.為了證實(shí)這種差異,本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和組織芯片免疫組織化學(xué)技術(shù)分別在基因水平和蛋白水平對(duì)差異表達(dá)的基因BCL11A進(jìn)行驗(yàn)證,并將BCL11A表達(dá)水平與臨床病理資料和患者預(yù)后進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,以明確BCL11A在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生,發(fā)展中的作用。
　　 3.為了弄

13、清BCL11A在NSCLC中上調(diào)的機(jī)理,本研究借助比較基因組雜交技術(shù)以期從基因組水平了解BCL11A基因拷貝數(shù)變異情況。
　　 4.另外,近幾年發(fā)現(xiàn)的一類稱之為微小RNA(microRNA)的非編碼RNA,能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá),廣泛參與非小細(xì)胞肺癌進(jìn)程。本研究應(yīng)用Agilent人類microRNA表達(dá)芯片分析37對(duì)配對(duì)的非小細(xì)胞肺癌與癌旁組織之間的microRNA表達(dá)差異,找到在非小細(xì)胞肺癌組織中下調(diào)的microR

14、NAs。同時(shí)通過(guò)miRGen生物學(xué)軟件分析,找到潛在調(diào)控BCL11A的microRNA分子集,然后與在非小細(xì)胞肺癌組織中下調(diào)的microRNA分子集進(jìn)行交集運(yùn)行,找到在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)下調(diào)同時(shí)又是潛在調(diào)控BCL11A的microRNA分子。
　　 5.探討這些microRNA分子的功能,并在分子水平研究驗(yàn)證microRNA對(duì)靶基因BCL11A的調(diào)控。
　　 初步結(jié)論
　　 1.BCL11A在非小細(xì)胞肺癌組織

15、中的表達(dá)無(wú)論是mRNA水平還是蛋白水平均明顯高于癌旁組織,提示原癌基因BCL11A在非小細(xì)胞肺癌中存在異常活化。
　　 2.BCL11A蛋白特異性地表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌組織,而在癌旁正常組織中不表達(dá),提示BCL11A蛋白可能作為一種非小細(xì)胞肺癌特異的腫瘤標(biāo)志物。
　　 3.BCL11A在非小細(xì)胞肺癌中上調(diào)存在著一定的組織特異性,在鱗癌中上調(diào)最明顯。
　　 4.BCL11A mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均與NSCLC患

16、者疾病分期和淋巴結(jié)狀態(tài)有關(guān),疾病分期為早期(Ⅰ-Ⅱ)、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的患者,BCL11A表達(dá)水平越高。
　　 5.BCL11A mRNA或BCL11A蛋白高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者無(wú)論是總生存期還是無(wú)病生存期均明顯優(yōu)于BCL11A低表達(dá)患者,BCL11A mRNA表達(dá)水平能獨(dú)立預(yù)測(cè)早期非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后無(wú)病生存期。而B(niǎo)CL11A蛋白表達(dá)水平不僅能預(yù)測(cè)早期NSCLC患者的無(wú)病生存,還能獨(dú)立預(yù)測(cè)早期NSCLC患者的術(shù)后總生存,提示BC