熒光標(biāo)記對(duì)B-16細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景： 轉(zhuǎn)移和侵襲是惡性腫瘤的顯著特征，也是臨床治療失敗和患者死亡的主要原因。治愈腫瘤的關(guān)鍵是去除機(jī)體內(nèi)的腫瘤組織，并預(yù)防其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制是癌癥研究的最熱點(diǎn)問(wèn)題之一，在體內(nèi)、外研究中也取得了很多成果，但是對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的早期事件由于缺乏有效的研究手段還有許多問(wèn)題沒(méi)有解決。在體內(nèi)還很難實(shí)時(shí)地捕捉、記錄到單個(gè)腫瘤細(xì)胞增殖至多個(gè)腫瘤細(xì)胞的克隆過(guò)程，其難點(diǎn)是在體內(nèi)無(wú)法區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。近年來(lái)應(yīng)用熒光染料或熒光蛋白基因標(biāo)記腫瘤

2、細(xì)胞，利用熒光顯微鏡在體內(nèi)、外實(shí)時(shí)觀察腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、增殖和轉(zhuǎn)移的研究散見(jiàn)報(bào)告，但是腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)熒光染色或熒光蛋白基因的導(dǎo)入，在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)，增殖、侵襲和粘附能力等是否有顯著影響，以及經(jīng)過(guò)標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)毛細(xì)血管網(wǎng)內(nèi)的狀態(tài)，粘附、增殖情況還沒(méi)有進(jìn)一步的研究。 目的： 觀察體外熒光標(biāo)記對(duì)B-16細(xì)胞形態(tài)、增殖、粘附和侵襲的影響，以及經(jīng)過(guò)標(biāo)記的B-16細(xì)胞在體內(nèi)毛細(xì)血管網(wǎng)中的粘附、增殖情況。 方法：

3、 pEGFP-N3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞株B16，建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)基因的惡性黑色素瘤細(xì)胞株B16/EGFP，熒光染料CMFDA標(biāo)記鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞株B16/CMFDA。分組：B16細(xì)胞為對(duì)照組(A組)，熒光染料CMFDA標(biāo)記的惡性黑色素瘤細(xì)胞為B16/CMFDA組(B組)，綠色熒光蛋白標(biāo)記的惡性黑色素瘤細(xì)胞為B16/EGFP組(C組)。倒置相差顯微鏡下觀察對(duì)照組、B16/CMFDA組和B16/EGFP組細(xì)胞貼

4、壁狀態(tài)和細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞記數(shù)法測(cè)定對(duì)照組、B16/CMFDA組和B16/EGFP組的細(xì)胞增殖曲線。MTT微量酶反應(yīng)比色法測(cè)定對(duì)照組、B16/CMFDA組和B16/EGFP組的粘附率；transwell小室檢測(cè)對(duì)照組、B16/CMFDA組和B16/EGFP組的細(xì)胞侵襲力。C57鼠尾靜脈注入熒光標(biāo)記的B16細(xì)胞(B、C組)，觀察B16細(xì)胞在體內(nèi)毛細(xì)血管網(wǎng)中的粘附、增殖。 結(jié)果： 倒置相差顯微鏡下觀察，在體外培養(yǎng)時(shí)無(wú)論是pEGF

5、P-N3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的B16 /EGFP細(xì)胞株還是熒光染料CMFDA標(biāo)記的B16/CMFDA細(xì)胞的貼壁狀態(tài)、形態(tài)無(wú)顯著變化。 細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，B16組第1-7天細(xì)胞數(shù)(×104)分別為5、12、25、70、220、510、810。B1 6／CMFDA組第1-7天細(xì)胞數(shù)分別為5、11.5、27、80、210、510、880。B16/EGFP組第1-7天細(xì)胞數(shù)分別為5、12.1、25.5、71、210、500、830。各組細(xì)胞生長(zhǎng)

6、曲線基本重疊，各組細(xì)胞均在接種的第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第7天細(xì)胞長(zhǎng)滿25cm2培養(yǎng)瓶。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明B16細(xì)胞組、B16/CMFDA．細(xì)胞組、B16/EGFP細(xì)胞組的增殖曲線無(wú)明顯差(P>0.05)。 37℃、5％CO2培養(yǎng)60分鐘，B16組、B16/CMFDA組、B16/EGFP組的OD值分別為O.2694±0.029，0.303±0.027，0.319±0.06。與對(duì)照組比較B16/CMFDA組、B16/EGFP組的粘附率分

7、別為3.4％、5.0％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析B16組、B16/CMFDA組、B16/EGFP組粘附率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 37℃、5％CO2培養(yǎng)48小時(shí)，B16組、B16/CMFDA組、B16/EGFP組穿透濾膜的細(xì)胞數(shù)分別為85.33±7.57、61.33±17.56、73.67±25.32。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析B16組、B16/CMFDA組、B16/EGFP組穿膜的細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論： 熒光染料