RNA干擾技術(shù)對(duì)前列腺癌細(xì)胞系A(chǔ)LVA-41端粒酶活性的抑制作用.pdf

1、自從1998年Fire等發(fā)現(xiàn)RNAi(RNAinterferer)現(xiàn)象以來，短短的幾年間人們對(duì)它的認(rèn)識(shí)和應(yīng)用速度是驚人的。RNA干擾是內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA誘發(fā)的mRNA水平上的基因沉默機(jī)制，具有高度特異性。21nt干擾性小RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可以誘導(dǎo)強(qiáng)有力的特異性RNAi作用，這一突破性研究進(jìn)展開創(chuàng)了人類疾病治療的新的研究領(lǐng)域，RNAi技術(shù)用于人類疾病治療已受到極大關(guān)注，尤其在AIDS、乙型肝炎和丙型肝炎等病毒感染性疾病和腫瘤治療

2、中的應(yīng)用研究最為活躍，并取得了令人鼓舞的成果。端粒酶在80％～90％的惡性腫瘤中表達(dá)，而在大多數(shù)正常體細(xì)胞不表達(dá)，端粒酶是一個(gè)通用的人類腫瘤標(biāo)志。端粒酶在前列腺癌和癌前病變中的高表達(dá)，提示端粒酶有可能應(yīng)用于前列腺癌的診斷，以及端粒酶抑制劑應(yīng)用于前列腺癌的治療。本實(shí)驗(yàn)探討DNA載體途徑的RNA干擾技術(shù)抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶的作用和機(jī)理，為腫瘤的基因治療尋求新的途徑。 方法:(1)針對(duì)hTERT小干擾RNA分子生成的質(zhì)粒載體的構(gòu)建，經(jīng)酶

3、切電泳及測(cè)序分析進(jìn)行鑒定；(2)重組RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至ALVA-41前列腺腫瘤細(xì)胞，以TRAP-ELISA方法觀察前列腺腫瘤細(xì)胞端粒酶活性；(3)通過Western-blot檢測(cè)前列腺腫瘤細(xì)胞端粒酶蛋白的表達(dá)水平；(4)用細(xì)胞記數(shù)法觀測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 結(jié)果:(1)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒mU6-hTERT-siRNA，經(jīng)酶切電泳及測(cè)序分析證實(shí)，目的序列成功插入到預(yù)計(jì)位點(diǎn)。(2)結(jié)果顯示以I745位置為靶位點(diǎn)的siRNA具

4、有相對(duì)較好的抑制作用，端粒酶活性有明顯的下降。(3)TRAP-PCR電泳結(jié)果顯示，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，以12.5％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，以此電泳結(jié)果可進(jìn)一步確認(rèn)TRAP-ELISA檢測(cè)結(jié)果。(4)hTERT-siRNA干擾可以影響ALVA-41細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)染I-745質(zhì)粒抑制ALVA-41細(xì)胞的增殖。 結(jié)論:(1)成功合成重組RNAi質(zhì)粒mU6-hTERT-siRNA；(2)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)可阻止hTERT基因的表達(dá)，抑