基于肝藥酶代謝的金鈴子散復(fù)方配伍研究.pdf

1、“辨證論治”是中醫(yī)藥認(rèn)識和治療疾病獨(dú)特的思維方法，中藥復(fù)方配伍是體現(xiàn)中醫(yī)理論和“辨證論治”思想的載體。揭示中藥復(fù)方配伍規(guī)律的科學(xué)內(nèi)涵，一直是中藥復(fù)方研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題；探究中藥配伍規(guī)律，對闡明中醫(yī)“辨證論治”理論的科學(xué)內(nèi)涵和中藥復(fù)方的作用機(jī)制有著重要意義。中藥復(fù)方配伍，從化學(xué)本質(zhì)上來講是不同中藥的多組份間構(gòu)成一個系統(tǒng)的、復(fù)雜的相互作用體系，這些相互作用的組份群是復(fù)方整體效應(yīng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。這些成分群可能直接作用于機(jī)體產(chǎn)生作用，也

2、可能進(jìn)入機(jī)體之后與機(jī)體代謝系統(tǒng)相互作用后產(chǎn)生藥理作用。如果說中藥化學(xué)解決的是中藥復(fù)方起效的物質(zhì)基礎(chǔ)，中藥藥理學(xué)解決的是中藥復(fù)方發(fā)生作用的結(jié)果，那么藥代動力學(xué)就是聯(lián)系起中藥化學(xué)和中藥藥理學(xué)的一個紐帶，它通過研究復(fù)方成分群在體內(nèi)的動態(tài)變化規(guī)律，揭示復(fù)方如何相互作用產(chǎn)生藥效作用。所以藥代動力學(xué)的興起和發(fā)展為研究中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)、配伍規(guī)律和作用機(jī)理開辟了新的研究思路和方法以及必要的手段。運(yùn)用藥代動力學(xué)研究方法定性、定量地分析中藥復(fù)方配伍后化學(xué)成

3、分在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄的動態(tài)變化規(guī)律，能夠真實(shí)的反映中藥的體內(nèi)過程，闡明中藥配伍后發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，是藥效配伍研究方法的強(qiáng)有力補(bǔ)充。所以，探討中藥復(fù)方成分群與機(jī)體代謝系統(tǒng)之間的相互作用是闡述配伍規(guī)律的有效途徑之一。
　　中藥復(fù)方最常見、最經(jīng)典的用藥方式是口服湯劑，方劑中的藥效物質(zhì)群必須經(jīng)過胃腸道的吸收進(jìn)入體內(nèi)才能發(fā)揮藥理效應(yīng)。腸道的吸收是決定藥物生物利用度和影響藥物發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵因素之一，因此，從腸道吸收的角度研究

4、方劑配伍時的吸收動力學(xué)變化，可以闡釋方劑配伍的科學(xué)內(nèi)涵。
　　藥物在機(jī)體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化主要由肝細(xì)胞內(nèi)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的肝藥酶催化，在肝臟中參與藥物代謝的代謝酶中以P450酶最為重要，人類肝微粒體中參與藥物代謝的P450酶比較簡單，主要有CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E和CYP3A五大類，由P450酶催化的I相反應(yīng)是其體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵性步驟，因?yàn)檫@一步反應(yīng)常常是藥物從體內(nèi)消除的限速步驟，它可以影響到藥物的許多重要的藥動學(xué)特

5、性。
　　中藥復(fù)方數(shù)以萬計(jì)，為了體現(xiàn)研究的代表性和科學(xué)性，本課題通過遴選臨床療效確切、應(yīng)用較為廣泛的金鈴子散為研究對象。金鈴子散由川楝子和延胡索等量配比而成，首見于劉完素《素問·病機(jī)氣宜保命集》為“療肝郁化火而致的胸脅、腹脘、疝氣痛、痛經(jīng)”等痛癥的代表方劑。方子雖小，但卻不失配伍原則，有明確的君臣佐使關(guān)系，方中用川楝子疏肝氣，泄肝火，為君藥，延胡索行氣活血，為臣使藥，二藥相配，氣行血暢，疼痛自止，功效卓著?；谛?fù)方或藥對的配伍研

6、究對于揭示中藥復(fù)方配伍規(guī)律有著先導(dǎo)和示范意義。
　　1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　本研究以經(jīng)典小復(fù)方金鈴子散為范例，基于藥代動力學(xué)的研究思路，從藥物吸收、代謝兩個主要環(huán)節(jié)著手，利用正交設(shè)計(jì)的方法，一方面，從體內(nèi)和體外兩個層面探索金鈴子散不同配比方對肝藥酶P450活性的影響(誘導(dǎo)或抑制作用)；另一方面，提出并建立適合中藥復(fù)雜系統(tǒng)研究的藥物吸收-代謝模型，探討金鈴子散不同配比方吸收行為、吸收-代謝行為與復(fù)方配伍間的內(nèi)在規(guī)律。從中藥復(fù)方與肝藥

7、酶代謝相互作用角度探討中藥復(fù)方配伍規(guī)律及其科學(xué)內(nèi)涵。
　　2實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果:
　　2.1金鈴子散及不同配比方對CYP1A2活性影響的研究
　　方法：采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表，將金鈴子散中的川楝子和延胡索作為兩因素，每個因素設(shè)3個不同劑量作為實(shí)驗(yàn)的三水平，研究金鈴子散9個不同配比及其相應(yīng)的單味藥物在體外和體內(nèi)對CYP1A2活性的影響。體外實(shí)驗(yàn)以肝微粒體為研究工具，采用單一探針非拉西丁觀察不同配伍的金鈴子散對CYP亞型(

8、CYP1A2)的半數(shù)抑制濃度(IC50)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用探針?biāo)幬锓?，先以金鈴子散對大鼠進(jìn)行預(yù)處理，再給予探針?biāo)?非拉西丁)后，應(yīng)用微透析采樣技術(shù)直接在肝臟采集樣本，測定非拉西丁和對乙酰氨基酚的體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)，考察金鈴子散不同配比方對酶(CYP1A2)活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交-t檢驗(yàn)和方差分析統(tǒng)計(jì)。
　　結(jié)果：川楝子、延胡索單味提取物和配比方1～9對肝藥酶CYP1A2的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為：0.0252±0.0052、0

9、.0121±0.0079、0.0919±0.0150、0.0719±0.0053、0.0282±0.00415、0.0754±0.0155、0.0628±0.0033、0.0919±0.0150、0.1976±0.0273、0.1591±0.0081、0.1311±0.0085 g-1-1，對CYP1A2活性無顯著抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，藥代參數(shù)顯示：金鈴子散不同配比方均能誘導(dǎo)CYP1A2活性，誘導(dǎo)作用強(qiáng)弱順序是：誘導(dǎo)劑組(方3)>方4(方

10、5)>方9(方6，方1，方2，方8，川楝子，延胡索組)>方7>正常對照組。
　　2.2金鈴子散及不同配比方對CYP3A4活性影響的研究
　　方法：采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表，將金鈴子散中的川楝子和延胡索作為兩因素，每個因素設(shè)3個不同劑量作為實(shí)驗(yàn)的三水平，研究金鈴子散9個不同配比及其相應(yīng)的單味藥物在體外和體內(nèi)對CYP3A4活性的影響。體外實(shí)驗(yàn)以肝微粒體為研究工具，采用單一探針睪酮觀察不同配伍的金鈴子散對CYP亞型(CYP3A4

11、)的半數(shù)抑制濃度(IC50)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用探針?biāo)幬锓ǎ纫越疴徸由Υ笫筮M(jìn)行預(yù)處理，再給予探針?biāo)?睪酮)后，應(yīng)用微透析采樣技術(shù)直接在肝臟采集樣本，測定其體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)，考察不同配比方對酶(CYP3A4)活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交-t檢驗(yàn)和方差分析。
　　結(jié)果：川楝子、延胡索單味提取物和配伍方1～9體外對肝藥酶CYP3A4的IC50值分別為2.59±0.33，0.87±0.30，1.14±0.20，1.00±0.13，1.19±0

12、.10，2.33±0.15，1.39±0.19，1.14±0.20，1.29±0.14，1.43±0.32，1.49±0.28 mg·L-1；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常對照組比較，金鈴子散不同配比方、川楝子和延胡索單味提取物處理組大鼠CYP3A4酶活性均降低，金鈴子散配比方抑制CYP3A4酶活性的強(qiáng)弱順序：方1(方4)>方7>方2(方5)>方8>方3>方9。
　　2.3 Cocktail探針?biāo)幬锓ㄓ^察金鈴子散及不同配比方對CYPs活

13、性的影響
　　方法：采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表，將金鈴子散中的川楝子和延胡索作為兩因素，每個因素設(shè)3個不同劑量作為實(shí)驗(yàn)的三水平，研究金鈴子散9個不同配比及其相應(yīng)的單味藥體外對CYPs活性的影響。實(shí)驗(yàn)以肝微粒體為研究工具，采用多探針?biāo)幬锓抢鞫?PHE)、香豆素(COM)、甲苯磺丁脲(TOL)、奧美拉唑(OME)、睪酮(TST)為工具，觀察金鈴子散的不同配伍對CYP亞型(CYP1.A2，CYP2A6，CYP2C9，CYP2C19和C

14、YP3A4)的半數(shù)抑制濃度(IC50)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交-t檢驗(yàn)和方差分析。
　　結(jié)果：Cocktail探針法川楝子、延胡索單味提取物和配伍方1～9體外對肝藥酶CYP1.A2的IC50值分別為0.029±0.004，0.015±0.006，0.096±0.015，0.077±0.003，0.033±0.005，0.079±0.016，0.068±0.009，0.096±0.015，0.194±0.023，0.156±0.048，0

15、.111±0.012 g·L-1；對肝藥酶CYP2A6的IC50值分別為0.051±0.003，0.059±0.009，0.129±0.013，0.068±0.004，0.064±0.007，0.070±0.013，0.079±0.008，0.129±0.013，0.054±0.010，0.060±0.013，0.091±0.010g·L-1；對肝藥酶CYP2C9的IC50值分別為0.149±0.020，0.125±0.013，0.06

16、7±0.005，0.059±0.004，0.064±0.005，0.077±0.003，0.061±0.006，0.067±0.005，0.059±0.004，0.064±0.003，0.077±0.003 g·L-1；對肝藥酶CYP2C19的IC50值分別為0.056±0.010，0.091±0.008，0.104±0.010，0.105±0.008，0.091±0.010，0.070±0.006，0.062±0.008，0.104±

17、0.010，0.094±0.010，0.085±0.009，0.069±0.005g·L-1；對肝藥酶CYP3A4的IC50值分別為：0.0031±0.0003，0.0010±0.0004，0.0014±0.0002，0.0010±0.0003，0.0019±0.0001，0.0025±0.0005，0.0016±0.0009，0.0014±0.0002，0.0019±0.0004，0.0023±0.0003，0.0017±0.0008

18、 g·L-1。Cocktail探針法對CYP1A2和CYP3A4的IC50與單一探針法數(shù)值上雖然不等同，但是結(jié)果的生物學(xué)意義一致。
　　2.4吸收-代謝模型的建立和驗(yàn)證
　　方法：中藥復(fù)雜體系的體內(nèi)過程(ADME/Tox)重點(diǎn)和核心是吸收和代謝環(huán)節(jié)，建立了吸收-代謝模型對于中藥藥效物質(zhì)、復(fù)方配伍研究意義重大。針對藥物體內(nèi)過程的特點(diǎn)建立中藥代謝研究的體外模型，將藥物的腸吸收模型和肝微粒體代謝模型結(jié)合起來，體外模擬藥物的吸收-代

19、謝過程，在外翻腸囊的基礎(chǔ)上，向腸囊外浴槽內(nèi)注入肝微粒體CYPs底物，30min后取樣，向腸囊內(nèi)加入肝微粒體及還原型輔酶Ⅱ，30min、60min后取樣，HPLC分析和測定吸收樣品中探針?biāo)幬锏脑图拔?代謝樣品中原型物、代謝物。
　　結(jié)果：單一探針吸收-代謝驗(yàn)證結(jié)果顯示吸收液樣品中能檢測到探針?biāo)幬镌?、吸?代謝樣品中能同時檢測到原型物、代謝產(chǎn)物；多探針吸收-代謝也驗(yàn)證上述結(jié)論，該模型可用于藥物的吸收和代謝過程研究。
　　2

20、.5基于吸收-代謝模型的金鈴子散及其配伍研究
　　方法：建立適合中藥研究的吸收一代謝模型，將藥物的腸吸收研究模型和肝微粒體代謝模型結(jié)合起來；向腸囊外浴槽內(nèi)注入不同配比的金鈴子散，30min后取樣，加入肝微粒體及還原型輔酶Ⅱ，30min、60min后取樣，HPLC定性和定量分析吸收樣品中金鈴子散可吸收組份及吸收-代謝樣品中可吸收-代謝組份，同時采用LC-MS進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：金鈴子散提取物中15個主要組份中的10個組份可被

21、小腸吸收，經(jīng)A-M模型代謝后出現(xiàn)一個新的組份峰；金鈴子散吸收組份比與配伍相關(guān)，川楝子是影響主要組份吸收比(Ar)和吸收-代謝比(Mr)的主要因素，延胡索次之，方1和方9主要組份吸收比最大，吸收-代謝比的順序：方5>方6(方1)>方9>方4>方3>方7>方2>方8。
　　3結(jié)論:
　　從中藥復(fù)方對肝藥酶的影響而言，金鈴子散配比方對肝藥酶CYP1A2活性有誘導(dǎo)作用，延胡索是誘導(dǎo)作用的主要因素；對CYP3A4酶的活性有抑制作用，配

22、伍之后復(fù)方抑制作用顯著增強(qiáng)，二者配伍顯示出協(xié)同抑制作用；Cocktail探針?biāo)幬锓w外實(shí)驗(yàn)顯示對CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19無顯著抑制作用。
　　從代謝酶對復(fù)方作用的角度而言，建立了適合中藥復(fù)雜體系研究的吸收-代謝模型并用于金鈴子散復(fù)方配伍研究，金鈴子散配伍可吸收組份比與方劑配伍相關(guān)，方1(川楝子：延胡索比為1:1)和方9(川楝子：延胡索比為4:3)主要組份的吸收比最大，方5、方6(方1)主要組份吸收.代謝比最大；同