放射配基法研究膽囊收縮素（CCK）受體在人的食管下括約肌的表達.pdf

1、目的：食管下括約肌是食管胃連接部增厚的肌束，由內層大彎側的套索纖維(sling fibers)和小彎側半環(huán)形的鉤狀纖維(clasp fibers)構成，這兩束肌肉共同維持LES的關閉狀態(tài)，其收縮和舒張功能調節(jié)機制非常復雜，包括神經系統(tǒng)、體液因素以及自身肌源性因素等多種因素。胃腸肽類激素作為體液因素的主要組成部分，承擔著不可替代的作用。CCK是一類能引起膽囊收縮的胃腸道多肽激素，具有調節(jié)膽囊收縮，胰腺分泌，促進胃排空等功能。現(xiàn)在，CCK成

2、為一類典型的腦腸肽，能夠以神經遞質或神經調質的形式發(fā)揮生理作用，所有這些生理作用都是其作用于相應受體而產生的結果。CCK受體根據其對CCK類似物和胃泌素及特異拮抗劑的親和力差異而分為兩種亞型-CCKA受體和CCK<,B>受體，并且有人將胃泌素受體與CCK<,B>受體統(tǒng)稱為CCK<,B>胃泌素受體。本研放射配基受體結合分析法，研究CCK<,A>受體和CCK<,B>受體與其激動劑<'3>H-CCK-8s的結合力，以及兩個受體分別在人的LES

3、的鉤狀纖維和套索纖維的表達情況，以證明哪種受體和那條肌纖維對LES的調節(jié)作用更占優(yōu)勢。 方法：選取2005年12月至2006年5月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院因食管中段癌行食管大部切除術患者7例，采集未受侵的套索纖維和鉤狀纖維，制成約8～12mm×4～6mm的肌條，1)用組織勻漿器加入TBS液4℃勻漿，勻漿液以4℃，1000×g離心10分鐘。2)棄上清后，采用美國PIERCE公司的膜蛋白提取試劑盒，將沉淀運用膜蛋白萃取法制備受體膜蛋

4、白，考馬斯亮藍G-250定量后存于-80℃?zhèn)溆谩?)取等量受體膜蛋白用蛋白印跡法證實CCK<,A>受體和CCK<,B>受體在LES的存在及初步比較其條帶。4)以<'3>H-CCK-8s為標記配基，用反應體系總體積為200 μl，使得<'3>H-CCK-8s與CCK受體充分結合，4℃恒溫振蕩孵育10h，進行飽和試驗。然后分別加入CCKA受體拮抗劑CR1409和CCKB受體拮抗劑CR2945至反應體系重復前面的過程進行競爭抑制試驗。以49型

5、硝基玻璃纖維濾膜采用負壓抽濾的辦法分離結合和游離配基，含有結合配基受體的濾膜置于液體閃爍計數(shù)儀中計數(shù)。實驗結果用Graphpad Prism4軟件和SPSS11.5軟件分析。 結果： 1 由蛋白印跡試驗得出CCK<,A>受體和CCKM<,B>受體在鉤狀纖維和套索纖維均表達，鉤狀纖維上，CCK<,A>受體和CCK<,B>受體表達的IOD值為22.328±1.042和12.454±0.294，二者有統(tǒng)計學差異(t=9.11

6、8，p=0.001)，在套索纖維上，CCKA受體和CCKB受體表達的IOD值為22.650±0.642和13.195±0.423，二者有統(tǒng)計學差異(t=12.299，p=0.000)，但是CCKA受體在套索纖維上和鉤狀纖維上無統(tǒng)計學差異(t=0.263，p=0.806)，CCKB受體在套索纖維上和鉤狀纖維上無統(tǒng)計學差異(t=1.439，p=0.224)。 2 飽和試驗中得出飽和曲線，并得出在LES的套索纖維上<'3>H-CCK

7、-8s與CCK受體的最大結合量 B<,max<'s>>為595.750±3.231cpm，平衡解離常數(shù)Kd<,s>為1.671±0.024mmol/L，而在鉤狀纖維上二者的最大結合量B<,max<'s>>為500.000±10.087cpm，Kd<,c>為1.437±0.024mmol/L。CCK受體與<'3>H-CCK-8s的最大結合量在鉤狀纖維和套索纖維上有統(tǒng)計學差意義(t=9.040，p=0.000)，平衡解離常數(shù)在鉤狀纖維和套索

8、纖維上有統(tǒng)計學差意義(t=6.898，p=0.000)，同時由數(shù)據可以看出套索纖維上的CCK受體與<'3>H-CCK-8s的結合較多。 3 競爭抑制實驗中得出CCK<,A>受體和CCK<,B>受體拮抗劑的競爭抑制曲線，同時在LES的套索纖維上CRl409的半量有效抑制濃度EC<,50><'1409>為2.798±0.104×10<'-9>mol/L，CR945的半量有效抑制濃度EC<,50><'294>為8.147±0.551

9、×10<'-9> mol/L，二者對<'3>H-CCK-8s和CCK受體結合的抑制作用有統(tǒng)計學差異(t=9.53，p=0.001)，而在鉤狀纖維上CRl409的半量有效抑制濃度EC<,50><'409>為3.165±0.187×10<'-9> mo1/L，CR945的半量有效抑制濃度EC<,50><'409>為9.583±0.50l×10<'-9> mol/L，二者對<'3>H-CCK-8s和CCK受體結合的抑制作用有統(tǒng)計學差異(t=1

10、1.99，p=0.000)，而且CRl409的抑制作用大于CR2945的。但是CRl409在鉤狀纖維和套索纖維上無統(tǒng)計學差異(t=1.72，p=0.161)，CR2945在鉤狀纖維和套索纖維上無統(tǒng)計學差異(t=1.93， p=0.126)。 結論： 1 <'3>H-CCK-8s與鉤狀纖維和套索纖維上CCK受體的結合為特異性結合，套索纖維上<'3>H-CCK-8s與CCK受體結合的情況優(yōu)于鉤狀纖維上的情況。 2

11、 CCK<,A>受體拮抗劑CRl409對<'3>H-CCK-8s與LES的CCK<,A>受體的特異性結合的抑制作用比CCK<,B>受體拮抗劑CR945更明顯。 3 兩肌條間拮抗劑與各自受體的親和力無差別。 4 飽和曲線所得出的CCK受體與<'3>H-CCK-8s的最大結合量和平衡解離常數(shù)在鉤狀纖維和套索纖維上的差異可由CCK<,A。受體在套索纖維比鉤狀纖維分布較多引起的。因此CCK<,A>受體在CCK-8s對LES的