消膏轉(zhuǎn)濁法逆轉(zhuǎn)肥胖型非酒精性脂肪肝模型大鼠肝臟脂肪變性的實驗研究.pdf

1、目的：非酒精性脂肪肝是一種無過量飲酒史，以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。隨著人民生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝炎(nonacohoficsteatohepatitis,NASH)發(fā)病逐漸增多。其中，病因與肥胖密切相關(guān)，且有年輕化的趨勢，在肥胖癥患者中發(fā)病率則高達(dá)60％～90％；肥胖兒童可達(dá)80.49％。目前普遍認(rèn)為NASH不再是良性病變，約25％可以發(fā)展為肝纖維化、8％可進(jìn)展為肝硬化而導(dǎo)致一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，不少學(xué)

2、者認(rèn)為NASH是隱源性肝硬化或非活動性小結(jié)節(jié)性肝硬化的前期病變。因此已成為全球普遍關(guān)注的醫(yī)學(xué)問題和社會問題。NASH尚無理想的防治藥物。中醫(yī)在防治NASH方面具有一定的優(yōu)勢。導(dǎo)師仝小林教授認(rèn)為：肥胖是非酒精性脂肪肝、2型糖尿病、血脂異常、高血壓、冠心病等諸多疾病的“共同土壤”，乃一因多病。從“膏”、“濁”論治肥胖及其相關(guān)疾病可使防治重心大大前移，體現(xiàn)了從源頭控制，“未病先防、既病防變”的思想。肥胖型非酒精性脂肪肝前期主要病因是肥胖。多與

3、飲食不節(jié)、久坐少動、情志失和、先天稟賦異常及臟腑功能失調(diào)有關(guān)。病機(jī)多為肝郁脾滯，中焦大氣不轉(zhuǎn)，氣機(jī)升降受阻，木郁土壅，致津液失調(diào)，精微物質(zhì)不歸正化，釀脂為膏，異位沉積于肝內(nèi)，阻滯肝絡(luò)，而成脂肪肝。膏濁與氣滯并見，氣血運行不暢，而瘀血內(nèi)生，濁瘀交阻，積結(jié)肝內(nèi)，久而化毒。治療上，則應(yīng)治其根本，從消膏轉(zhuǎn)濁立法；病程已久，膏濁未盡，瘀滯之象漸露，則應(yīng)加強(qiáng)化瘀方藥的應(yīng)用，故立法為消膏、轉(zhuǎn)濁、祛瘀、排毒。臨床使用消膏轉(zhuǎn)濁方治療肥胖型非酒精性脂肪肝取

4、得較好療效。本課題采用國內(nèi)外公認(rèn)的研究模型，結(jié)合NASH的現(xiàn)代研究成果，用病理學(xué)、生物化學(xué)、免疫組化、分子生物學(xué)等技術(shù)，觀察非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟組織學(xué)特點、肝功、血脂、血糖、胰島素及肝勻漿中FFA、MDA、SOD、TNF-α和Leptin的變化情況，以及CYP2E1、：InsR和IRS-2 mRNA表達(dá)情況，闡明消膏轉(zhuǎn)濁方的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療本病提供理論依據(jù)。 方法：實驗分兩部分進(jìn)行： 第一部分：消膏轉(zhuǎn)濁方的療

5、效}生研究(實驗Ⅰ)Wister雄性SPF級大鼠40只，體重180—220克。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后。隨機(jī)分為5組。正常組(n=8)、模型組(n=8)、消膏轉(zhuǎn)濁組(n=8)和羅格列酮對照組(n=8)，以及飲食控制組(n=8)。同時自實驗開始起，正常組以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)；其余組的大鼠每天飼以高脂飼料(即標(biāo)準(zhǔn)飼料的基礎(chǔ)上加14％豬油、1％膽固醇)，其蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物提供能量分別為18％、45％、37％。每天測定大鼠的攝食量，每周測定大鼠體重。

6、 造模8周后，正常組飲食同前；模型組繼續(xù)高脂喂養(yǎng)；消膏轉(zhuǎn)濁治療組以及羅格列酮組改為普通飼料喂養(yǎng)，同時給予藥物治療。消膏轉(zhuǎn)濁方劑量為成人劑量10倍量(濃度為1.8生藥/ml，灌胃勤6.44ml/kg)；羅格列酮3mg/kg·d(濃度0.75mg/ml，灌胃勤4ml/kg灌胃治療4周；飲食控制組改為普通飼料喂養(yǎng)，不用藥物治療，共為4周。給藥4周后(即實驗12周)，大鼠清醒狀態(tài)下固定于鼠板上，進(jìn)行頸靜脈抽血2ml，3000rpm離心1

7、0min，取血清-20℃儲存，統(tǒng)一進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。大鼠恢復(fù)2天后，進(jìn)行正常血糖-高胰島素鉗夾實驗(簡稱鉗夾實驗)，鉗夾實驗結(jié)束后，從頸動脈取血，按常規(guī)制備血清，-20℃中凍存待相關(guān)檢測指標(biāo)分析用。頸動脈采血后處死動物，迅速取出肝臟，用濾紙吸干液體并稱重，并立即從肝臟的同一部位切取1塊肝組織，取一小塊切成約1cm<'3>大小，用10％磷酸緩沖甲醛液固定，送電鏡觀察，余下部分切成1.0cm×1.0cm×1.0cm在10％石中性甲醛固定后制

8、備石蠟切片。HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，評估脂肪變性和炎癥活動程度。肝臟其余部分根據(jù)測定指標(biāo)的要求，用錫箔紙分塊包裹，液氮保存。同時切取腸周圍、雙腎及附睪脂肪墊并稱重。于模型建立及給藥期間觀察記錄動物體重、食欲、行為、狀態(tài)、毛發(fā)及死亡情況。計算肝指數(shù)。用全自動生化分析儀檢測血清中的ALT、AST、CHO、TG、HDL-C、LDL-C，用普通分光光度計檢測FFA。 第二部分：消膏轉(zhuǎn)濁方的機(jī)制研究(實驗Ⅱ-Ⅳ)動物造模、分組、用藥情

9、況同實驗Ⅰ。鉗夾實驗結(jié)束后，取材同上。用快速葡萄糖分析儀檢測空腹及穩(wěn)態(tài)血糖；用放免法檢測胰島素：用半自動分光光度計檢測肝勻漿MDA、SOD；用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測肝勻漿中的TNF-α和Leptin；用免疫組化法檢測CYP2E1的蛋白表達(dá)；用實時熒光定量。PCR檢測CYP2E1、InsR及IRS-2mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 第一部分：消膏轉(zhuǎn)濁方的療效學(xué)研究(實驗Ⅰ)根據(jù)模型組大鼠肝組織病理及肝功能狀態(tài)，成功復(fù)

10、制大鼠NASH動物模型。與空白模型組相比，消膏轉(zhuǎn)濁組大鼠體重明顯降低(P<0.01)；肝指數(shù)明顯降低(P<0.01)，腹脂明顯減少(P<0.01)；肝臟病理顯示：消膏轉(zhuǎn)濁組大鼠肝細(xì)胞脂肪沉積，炎癥活動程度皆明顯改善(P<0.01)；消膏轉(zhuǎn)濁方可以降低血清ALT、AST(P<0.05)，CHO、TG及LDL-C(P<0.01)；并可以顯著地降低大鼠肝組織勻漿中的FFA的含量(P<0.01)。療效優(yōu)于單純飲食組。 第二部分：消膏轉(zhuǎn)濁

11、方的機(jī)制學(xué)研究(實驗Ⅱ—Ⅳ) (1)消膏轉(zhuǎn)濁法對非酒精性脂肪肝大鼠肝組織腫瘤壞死因子α及瘦素影響的實驗研究：與模型組相比，消膏轉(zhuǎn)濁方能夠顯著地降低肝組織中的TNF-α(P<0.01)，降低肝組織中的瘦素(P<0.05)； (2)消膏轉(zhuǎn)濁法對非酒精性脂肪肝大鼠脂質(zhì)過氧化反應(yīng)影響的實驗研究：消膏轉(zhuǎn)濁方可以顯著降低大鼠肝組織勻漿中的MDA含量，提高SOD的活性(P<0.01)。免疫組化結(jié)果顯示：消膏轉(zhuǎn)濁組肝細(xì)胞內(nèi)CYP2E1的

12、表達(dá)局限在腺泡Ⅲ區(qū)中央靜脈邊緣周圍的肝細(xì)胞內(nèi)。定量分析結(jié)果顯示：與模型組相比，消膏轉(zhuǎn)濁組肝細(xì)胞中CYP2E1染色陽性的細(xì)胞面積和MOD值顯著低于模型組(P<0.01)；優(yōu)于單純飲食組。實時熒光定量結(jié)果：與模型組相比，消膏轉(zhuǎn)濁組肝細(xì)胞中CYP2ElmRNA顯著低于模型組(P<0.01)。(3)消膏轉(zhuǎn)濁法對非酒精性脂肪肝大鼠胰島素抵抗影響的實驗研究：鉗夾實驗結(jié)果顯示：與漠型組相比，消膏轉(zhuǎn)濁方能夠顯著提高肥胖型非酒精性脂肪大鼠的葡萄糖輸注率(

13、P<0.01)；空腹胰島素比夠結(jié)果：與模型組相比，消膏轉(zhuǎn)濁組血清空腹胰島素含量顯著降低(P<0.01)；實時熒光量結(jié)果顯示：消膏轉(zhuǎn)濁組InsR mRNA與IRS-2 mRNA的表達(dá)均顯著高于模型組(P<0.01)。 結(jié)論： 1 消膏轉(zhuǎn)濁方能明顯降低NAFL大鼠體重、肝指數(shù)，并且可以顯著減少大鼠腸周圍脂肪組織重量。顯示消膏轉(zhuǎn)濁方對大鼠內(nèi)臟肥胖有一定減肥作用，減輕內(nèi)臟肥胖可能是消膏轉(zhuǎn)濁方治療大鼠非酒精性脂肪肝病變的作用機(jī)制之

14、一。 2 消膏轉(zhuǎn)濁方可以降低肝細(xì)胞內(nèi)脂肪的沉積，從而減輕脂肪對肝細(xì)胞造成的水腫、缺氧以及炎癥等損害，具有逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪沉積的功能。 3 消膏轉(zhuǎn)濁方可改善非酒精性脂肪肝大鼠肝功能，具有一定的保肝作用，并且可顯著降低肥胖型非酒精性脂肪肝大鼠的血脂及肝勻漿中的FFA，具有保肝降酶改善脂代謝的作用。 4 消膏轉(zhuǎn)濁方可能夠通過降低肝組織中INF-α的含量，間接減輕脂肪質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而減輕肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)；降低瘦索的含量，改

15、善瘦素抵抗，減輕胰島素抵抗。 5 消膏轉(zhuǎn)濁方可以顯著地降低大鼠肝組織勻漿中的MDA，提高SOD的活性，抑制肝細(xì)胞內(nèi)CYP2E1的蛋白及基因的表達(dá)；提示：消膏轉(zhuǎn)濁方抑制肝CYF2E1的表達(dá)，提高肝組織抗氧化能力，緩解氧化應(yīng)激，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生是其治療脂肪肝的機(jī)制之一。 6 消膏轉(zhuǎn)濁方可以提高葡萄糖輸注率，降低血清中的胰島素含量，改善胰島素抵抗的狀態(tài)。在胰島素信號傳導(dǎo)通路上，消膏轉(zhuǎn)濁方通過增強(qiáng)肝細(xì)胞胰島素受體和胰島素