磁性粒子表面修飾及其在功能性小分子作用組學研究中的應用.pdf

1、本文介紹了以磁性粒子為載體,通過其表面的化學基團分別連接天然產(chǎn)物石杉堿甲（Hup A）和二腺苷四磷酸（Ap4A）,經(jīng)過磁分離,分別從噬菌體cDNA展示庫和哺乳動物的腦組織裂解液里篩選Hup A的靶點,以及從原核生物細胞裂解液和真核生物組織裂解液里篩選Ap4A的靶點的研究。通過毛細管電泳技術分析了篩選出的特異性噬菌體與Hup A的結合,又通過表面等離子共振技術驗證了經(jīng)體外克隆表達的篩選到的特異性噬菌體基因所在蛋白與Hup A的結合。

2、>　　本論文首先采用化學共沉淀的方法,以用乳酸聚合而成的醇酸聚合物為高分子模板,制備出表面帶有羧基的磁性粒子。通過羧基與其它化學基團的反應,可以有效地連接各種生物活性分子或藥物，且連接后的磁性粒子可以穩(wěn)定存在于水溶液中并具有順磁性，因而在生物醫(yī)學分離等領域具有潛在的應用價值。
　　功能性小分子,特別是天然產(chǎn)物,是現(xiàn)代醫(yī)藥的主要來源,在幫助人類戰(zhàn)勝病魔的過程中,發(fā)揮著舉足輕重的作用。根據(jù)天然產(chǎn)物的來源我們往往可以判斷出它們的功能,而

3、且在一些疾病模型上也部分驗證了其治療作用,但大多天然產(chǎn)物沒有明確的分子靶點，有些作用機制尚不清楚，這就為尋找和合成天然產(chǎn)物的類似物或替代品或更優(yōu)產(chǎn)品,以及進一步揭示疾病的病因等造成一定的困難。因而結合已有的藥物靶點篩選技術,建立更行之有效的天然產(chǎn)物靶點篩選方法以找到其可能的未知作用靶點,成為加速現(xiàn)代醫(yī)藥進程的關鍵步驟。
　　本論文首先將我國傳統(tǒng)中草藥蛇足石杉的有效成分Hup A連接在磁性粒子的表面，分別從噬菌體cDNA展示庫和哺乳

4、動物腦組織裂解液中進行靶點篩選。通過幾輪磁生物淘洗，親和篩選出二種重復出現(xiàn)的對Hup A特異性結合的噬菌體。通過PCR、基因測序和序列比對，在基因庫中找到特異性噬菌體展示基因所在的蛋白，并通過毛細管電泳技術檢測了兩種特異性噬菌體以及一種非特異性噬菌體與Hup A的體外結合，結果表明篩選出的兩種特異性噬菌體和Hup A之間具有一定的結合，而非特異性噬菌體與Hup A基本沒有結合,從而排除了篩選到的噬菌體是磁性粒子非特異性吸附的結果的可能性

5、。再通過原核表達的方法,對其中一種特異性噬菌體展示基因所在的功能性蛋白-線粒體NADH脫氫酶subunit1進行了體外表達及純化,并通過表面等離子共振技術檢測了純化后的蛋白與Hup A之間的結合,得到了二者之間的結合常數(shù),說明二者之間確實存在一定的相互作用。通過真核組織裂解液的篩選，又一功能蛋白mitochondria ATP synthase被重復篩選出來。所有這些結果，再結合他人關于Hup A功能的研究，在很大程度上說明Hup A很

6、可能通過對神經(jīng)細胞線粒體功能的調節(jié)來治療阿爾茨海默癥（AD），而線粒體的某些功能蛋白，比如NADH脫氫酶subunit1和ATP synthase則有可能成為Hup A的新的作用靶點。具體地說，通過與這些酶相互作用，Hup A很可能作為他們的激動劑改善其活性，從而促進氧化呼吸鏈的電子傳遞，增加ATP的產(chǎn)生和能量的新陳代謝，來滿足AD以及其它神經(jīng)退行性疾病病人的受損神經(jīng)元對于能量的需求。
　　除了Hup A以外，我們還在體外化學合成

7、了帶有生物素的Ap4A，并將其連接到表面包被有鏈霉親和素的磁性粒子上。同樣通過磁生物淘洗，分別從大腸桿菌細胞和哺乳動物組織裂解液里篩選 Ap4A的結合蛋白。對于原核篩選來說，一個特異性的蛋白條帶在六次篩選過程中均被重復篩選到；而對于真核篩選來說，4個特異性的蛋白條帶被重復篩選到。經(jīng)質譜鑒定，Ap4A的已知靶點GroEL被篩選出來。這不僅表明磁生物淘洗方法在功能性小分子靶點篩選中的可行性，而且加大了其它被篩選出的蛋白,特別是IMP deh

8、ydrogenase和部分真核熱休克家族蛋白（Hsp）成為Ap4A未知靶點的可能性。可以說本部分實驗是磁性粒子在天然產(chǎn)物靶點篩選中的又一個嘗試性的應用，也是對將此方法應用在Hup A靶點篩選上的延伸和驗證。
　　兩部分實驗充分證明，通過與噬菌體展示技術和質譜基礎上的蛋白質組學技術相結合，以磁性粒子為基質的親和淘洗色譜將可能成為鑒定功能性小分子，特別是天然產(chǎn)物的未知靶點的一種新的有效的方法，為進一步研究功能性小分子的分子作用機制，體