氟康唑和抗菌藥物聯(lián)用對(duì)白色念珠菌體外活性與機(jī)制研究.pdf

1、近年來，隨著廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑和細(xì)胞毒藥物的廣泛應(yīng)用，修復(fù)裝置的不斷發(fā)展與生命維持技術(shù)的不斷進(jìn)步，免疫功能低下患者（艾滋病，器官移植，以及接受放、化療的癌癥患者）的不斷增多，導(dǎo)致真菌感染的發(fā)病率和死亡率不斷上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，深部真菌的感染多由念珠菌引起，其中以白色念珠菌(Candida albicans)比例最高，而且，深部白色念珠菌感染致死率高達(dá)40％。在長期廣泛的臨床使用中，抗真菌藥物氟康唑的耐藥問題變得日益嚴(yán)重，給臨床用藥選

2、擇帶來了巨大的壓力。在大力研究新型抗真菌藥物的同時(shí)，從現(xiàn)有的藥物中找出可以增加白色念珠菌對(duì)現(xiàn)有藥物敏感性的藥物也同樣重要。目前，聯(lián)合用藥作為解決耐藥真菌感染的主要方法之一，成為近年來的研究熱點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注。
　　 白色念珠菌在臨床使用中可能會(huì)形成各種不同的耐藥機(jī)制。目前已經(jīng)明確的對(duì)唑類藥物的耐藥機(jī)制包括：藥物作用靶位改變；細(xì)胞膜通透性降低；外排泵功能加強(qiáng)；甾醇代謝途徑改變；生物膜形成等。
　　 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道米諾環(huán)素具有較

3、弱的抗真菌活性，較高濃度的米諾環(huán)素對(duì)白色念珠菌效果較好。此外，國內(nèi)外已有研究證實(shí)磷霉素，大環(huán)內(nèi)脂類抗菌藥物，氟喹諾酮類等藥物能抑制銅綠假單胞菌生物膜的產(chǎn)生。那么此類藥物是否能夠同樣影響白色念珠菌及其生物膜的結(jié)構(gòu)？本實(shí)驗(yàn)選取了一系列的抗菌藥物與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用，目的在于篩選出具有協(xié)同作用的最佳藥物濃度的組合，并進(jìn)一步分別研究其對(duì)可能的耐藥機(jī)制的影響。
　　 1.氟康唑與抗菌藥物的聯(lián)合抗真菌作用
　　 參照CLSI M27-A

4、2方案，將米諾環(huán)素、利福平、氧氟沙星、阿奇霉素和磷霉素的濃度分別設(shè)置為32-0.5μg/ml、32-0.5μg/ml、8-o.125μg/ml、32-0.5μg/ml和64-lμg/ml，F(xiàn)LC為512-0.5μg/ml，氟康唑濃度范圍0.5-512μg/ml，分別對(duì)敏感菌株和耐藥菌株進(jìn)行藥物的抗真菌作用測定。結(jié)果表明單用米諾環(huán)素對(duì)所有菌株的抗真菌作用都很弱，其他抗菌藥物單用幾乎沒有抗真菌作用。應(yīng)用棋盤法測定氟康唑與抗菌藥物的聯(lián)合抗真菌

5、作用，以分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)（FICI法）、非參數(shù)反應(yīng)面（△E法）進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示藥物聯(lián)合對(duì)白色念珠菌耐藥株作用效果較好，其中利福平、米諾環(huán)素和氧氟沙星的FICI結(jié)果分別為0.02、0.035和0.035:△E值的加和(∑SYN)分別為1177％、1195％和1256％，成強(qiáng)協(xié)同作用。聯(lián)合用藥除利福平外對(duì)敏感菌均表現(xiàn)為無關(guān)作用。對(duì)FICI法和△E法這兩種評(píng)價(jià)方法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，△E法更適用于評(píng)價(jià)抗真菌藥物與非抗真菌藥物的聯(lián)合作用效果。<

6、br>　　 應(yīng)用時(shí)間-殺菌曲線法測定氟康唑與抗菌藥物對(duì)耐藥白色念珠菌CA10的聯(lián)合抗真菌作用，在培養(yǎng)后的第O、6、12、24、48h分別取樣，通過活菌計(jì)數(shù)和XTT（二甲氧唑黃法）兩種方法評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥與真菌細(xì)胞的數(shù)量關(guān)系，結(jié)果顯示氟康唑聯(lián)合利福平、米諾環(huán)素和氧氟沙星效果較單用氟康唑好，而阿奇霉素和磷霉素對(duì)氟康唑幾乎沒有增效作用。
　　 2.聯(lián)合用藥對(duì)氟康唑透過白色念珠菌生物膜的影響
　　 應(yīng)用膜滲透的方法.“三明治”法對(duì)

7、氟康唑與抗菌藥物單用和分別聯(lián)用組進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)于耐藥菌株，400μg/ml的氟康唑單用時(shí)抑菌圈<14mm,氟康唑聯(lián)合米諾環(huán)素、利福平和阿奇霉素在兩種不同濃度時(shí)抑菌圈>19mm，均比單用氟康唑的抑菌圈大，說明聯(lián)合用藥透過的藥物增多，從而增強(qiáng)了氟康唑的作用效果，表現(xiàn)出肉眼可見的效果；氧氟沙星和環(huán)丙沙星僅僅在濃度較大時(shí)效果較明顯，在結(jié)果圖片上看在濃度較小的情況下，作用與單用氟康唑差別不大；而磷霉素表現(xiàn)為無關(guān)作用。對(duì)于敏感菌抗菌藥物對(duì)氟康唑的效果

8、弱于耐藥菌株，可初步證明耐藥與生物膜相關(guān)。
　　 3.聯(lián)合用藥對(duì)生物膜內(nèi)細(xì)胞活性的影響
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證“三明治”法的結(jié)果，應(yīng)用廣泛評(píng)價(jià)細(xì)菌和酵母菌活性的熒光指示劑熒光素二乙酸酯(FDA)來觀察膜內(nèi)細(xì)胞的活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)米諾環(huán)素、利福平和氧氟沙星均有增強(qiáng)氟康唑滲透的作用，與“三明治”實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)的性質(zhì)基本一致；而阿奇霉素卻表現(xiàn)出不同的性質(zhì)，首先細(xì)胞數(shù)量比單用氟康唑組略有減少，其次細(xì)胞代謝活性也很強(qiáng)，而“三明治”實(shí)驗(yàn)中聯(lián)

9、合用藥組與氟康唑單用組卻有肉眼可見的協(xié)同作用，因此，阿奇霉素對(duì)氟康唑增敏的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究；磷霉素同樣幾乎沒有作用。
　　 4.米諾環(huán)素增敏作用與胞內(nèi)鈣離子的關(guān)系
　　 實(shí)驗(yàn)以第三代熒光染料Fluo-3/AM負(fù)載真菌細(xì)胞，以流式細(xì)胞術(shù)測定分析藥物作用與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化的關(guān)系。菌株在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，以D-Hanks緩沖液清洗細(xì)胞，重懸并調(diào)節(jié)菌濃度約為107CFU/ml，37℃120rpm下3

10、μM的Fluo-3/AM避光負(fù)載30min，流式細(xì)胞儀測定藥物加入后細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化。結(jié)果顯示，米諾環(huán)素對(duì)唑類藥物抗耐藥菌的增敏作用在于促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)鈣庫的鈣的釋放，極大的提高了胞漿內(nèi)鈣離子濃度。
　　 5.細(xì)胞外的鈣調(diào)節(jié)因素與聯(lián)合用藥的關(guān)系
　　 應(yīng)用平板劃線法測定氟康唑與抗菌藥物對(duì)耐藥白色念珠菌CA10、CA137，敏感白色念珠菌CA8、CA14的聯(lián)合抗真菌作用以及細(xì)胞外的鈣調(diào)節(jié)對(duì)聯(lián)合作用的影響。設(shè)置4.5x105C

11、FU/m l的菌液劃線接種于含有一定濃度的氟康唑與抗菌藥物以及各種鈣調(diào)節(jié)劑的YPD瓊脂培養(yǎng)基上，35℃恒溫培養(yǎng)48h。結(jié)果顯示，米諾環(huán)素顯著增強(qiáng)了唑類藥物對(duì)耐藥菌的作用，稍稍增強(qiáng)了唑類藥物對(duì)敏感菌的作用；低濃度鈣離子對(duì)耐藥菌敏感菌都有生長促進(jìn)作用，可以減弱聯(lián)合用藥的效果：高濃度鈣離子、鈣離子絡(luò)合劑EDTA對(duì)耐藥菌敏感菌都有生長抑制作用，可以增強(qiáng)聯(lián)合用藥的效果；鈣通道阻滯劑貝尼地平可顯著增強(qiáng)聯(lián)合用藥對(duì)耐藥菌和敏感菌的作用。綜合上述細(xì)胞內(nèi)鈣

12、的變化，可以推測米諾環(huán)素對(duì)氟康唑的曾敏作用主要干擾細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放。
　　 6.米諾環(huán)素對(duì)細(xì)胞內(nèi)唑類藥物蓄積的影響
　　 羅丹明6G(Rhodamine6G,R6G)是一種熒光物質(zhì)，可被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入真菌細(xì)胞，與氟康唑同為白色念珠菌主動(dòng)外排泵CDR(Candida Drug Resistance)的底物。我們可以用流式細(xì)胞術(shù)研究藥物對(duì)白色念珠菌吸收、泵出羅丹明6G的影響。選取耐藥菌CA10、CA135，敏感菌CA8和CA14，