BMP-2和BMSCs結(jié)合N-HA-N-LDIG復(fù)合材料修復(fù)兔橈骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文對BMP--2和BMSCs結(jié)合n--HA/n--LDIG復(fù)合材料修復(fù)兔橈骨缺損進(jìn)行了研究。本研究分為三個部分：
　　第一章：兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞。
　　目的：探討兔BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法，探討B(tài)MSCs在體外增殖，定向分化能力。
　　方法：取兔股骨的骨髓沖洗液，采用Percoll分離液密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離、培養(yǎng)、純化兔BMSCs，光鏡下觀

2、察傳代細(xì)胞生長狀況和形態(tài)變化;MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，繪制生長動力學(xué)曲線;HE染色形態(tài)觀察和流式細(xì)胞儀抗體鑒定兔BMSCs表面標(biāo)記物;體外誘導(dǎo)P3 BMSCs向成骨細(xì)胞分化，對誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞進(jìn)行Gomori鈣鈷法ALP染色和茜素紅鈣礦化結(jié)節(jié)染色鑒定向成骨分化的能力。
　　結(jié)果：所分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一，沿胞體長軸生長，呈旋渦狀、網(wǎng)狀、梭狀、放射狀，形成較典型的BMSCs。P3 BMSCs的生長曲線大致呈S型，第7～11天細(xì)胞處

3、于高速增長期，細(xì)胞數(shù)量迅速增加;HE染色BMSCs形態(tài)呈長梭形或長三角形，細(xì)胞核漿比例大，核藍(lán)染，胞漿豐富紅染。流式檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物顯示BMSCsCD44表達(dá)百分率為98.63％，呈陽性，而CD45表達(dá)呈陰性。P3BMSCs在體外經(jīng)成骨誘導(dǎo)3周后，Gomori鈣鈷法染色ALP呈陽性，胞漿顯示有灰黑色顆?；蜃睾谏蚝谏恋?。茜素紅染色呈陽性，細(xì)胞間出現(xiàn)致密的圓形或者卵圓形礦化結(jié)節(jié)。
　　結(jié)論：應(yīng)用Percoll分離液密度梯度離心法

4、和貼壁篩選法結(jié)合能分離、培養(yǎng)出兔BMSCs，是一種比較理想獲取兔BMSCs的方法;兔P3 BMSCs純度較高和良好的增殖能力，具有向成骨細(xì)胞定向分化的生物學(xué)特性，是組織工程理想的種子細(xì)胞，也為后續(xù)進(jìn)行骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　第二章：n-HA/n-LDIG復(fù)合材料的制備及與BMSCs體外復(fù)合培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)評價。
　　目的：以賴氨酸鹽，甘油及n-HA為主要原料，制備出一種新型n-HA/n-LDIG復(fù)合材料，分析其

5、與BMSCs體外復(fù)合培養(yǎng)的生物相容性，探討其作為組織工程支架的可行性。
　　方法：選擇賴氨酸鹽和甘油為原材料，通過有機(jī)合成、聚合反應(yīng)、納米化、超臨界抗溶劑結(jié)晶、超聲分散等技術(shù)制備出n-HA/n-LDIG復(fù)合材料。電鏡觀察其結(jié)構(gòu)及計(jì)算孔隙率，細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞對復(fù)合材料的黏附能力，MTT法檢測復(fù)合材料對細(xì)胞增殖的影響，ALP活性和鈣含量測定觀察復(fù)合材料對細(xì)胞分化的影響。
　　結(jié)果：n-HA/n-LDIG復(fù)合材料肉眼為白色散在，

6、為比較均勻的粉狀固體。掃描電鏡可見類似天然松質(zhì)骨的三維孔洞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，透射電鏡可見排列不規(guī)則的晶須和空穴。共培養(yǎng)從2h至10h，隨時間細(xì)胞的黏附率有所增加，其中6h時細(xì)胞黏附率明顯高于4h時，8h時明顯高于6h時，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示共培養(yǎng)第2天到第16天，細(xì)胞在復(fù)合材料上數(shù)量隨時間而增加，特別是從第6天開始復(fù)合材料上的細(xì)胞數(shù)量迅速增加，細(xì)胞處于對數(shù)生長期，12天后過渡到生長平臺期，增殖緩慢。從第4天開

7、始，黏附細(xì)胞的ALP相對活性和鈣相對含量迅速上升;第8天時ALP相對活性和鈣相對含量明顯高于第4天時，第12天明顯高于第8天時，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);12天后ALP相對活性和鈣相對含量增加不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：制備的n-HA/n-LDIG復(fù)合材料具備適宜的孔隙率和孔徑，組成性質(zhì)相似于天然骨結(jié)構(gòu)，具有良好的生物學(xué)特性，是一種新型的納米骨修復(fù)材料。n-HA/n-LDIG復(fù)合材料具備良好的細(xì)胞相容性，能為

8、成骨細(xì)胞在其表面生長、增殖、分泌基質(zhì)提供良好的微環(huán)境，是一種良好的骨修復(fù)替代材料，為其作為骨的快速修復(fù)和骨組織工程支架材料奠定了基礎(chǔ)。
　　第三章：BMP-2和BMSCs結(jié)合n-HA/n-LDIG復(fù)合材料修復(fù)兔橈骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究。
　　目的：構(gòu)建兔橈骨缺損模型，探討B(tài)MP-2和BMSCs結(jié)合n-HA/n-LDIG復(fù)合材料修復(fù)兔橈骨缺損的效果。
　　方法：取新西蘭大白兔構(gòu)建兔橈骨缺損模型，實(shí)驗(yàn)組植入BMP-2和BMSCs

9、結(jié)合n-HA/n-LDIG復(fù)合材料，對照組植入BMSCs結(jié)合n-HA/n-LDIG復(fù)合材料，空白組不植入任何材料。分別于2、4、8、12周隨機(jī)處死家兔，進(jìn)行動物大體觀察，X線檢查和Lane-Sandhu放射學(xué)評分觀察骨缺損處愈合情況，通過組織學(xué)檢查和Lane-Sandhu組織學(xué)評分觀察骨缺損處的修復(fù)情況。
　　結(jié)果：所有實(shí)驗(yàn)動物橈骨骨缺損模型構(gòu)建均成功，未見皮下和肌肉組織充血、水腫、滲出及感染等現(xiàn)象。從大體觀察，X線檢查和組織學(xué)檢

10、查等發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，實(shí)驗(yàn)組修復(fù)效果優(yōu)于對照組，對照組優(yōu)于空白組。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3、6、9周新生骨所占骨缺損面積百分比，Lane-Sandhu放射學(xué)評分，新生骨所占骨缺損面積百分比及Lane-Sandhu組織學(xué)評分均明顯高于對照組，對照組均明顯高于空白組，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：BMP-2明顯夠促進(jìn)早期成骨，縮短成骨時間，加速骨缺損區(qū)骨組織的再生和鈣化;BMP-2和BMSCs結(jié)合n-HA/n-LDIG復(fù)合