內(nèi)皮型一氧化氮合成酶的表觀遺傳學改變在高血糖“代謝記憶”中的作用及機制研究.pdf

1、目的:高血糖“代謝記憶”效應同糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關,然而其具體機制目前仍尚未明確。血管內(nèi)皮細胞型一氧化氮合酶(eNOS)功能紊亂在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)展中發(fā)揮了關鍵總用。因此,本研究擬建立高血糖代謝記憶細胞模型及動物模型,觀察eNOS功能紊亂在糖尿病高血糖“代謝記憶”效應中是否發(fā)揮了重要作用,并對其具體機制進行探討。
　　方法:高血糖代謝記憶人主動脈細胞分為4組:1)正常對照組,5.5mM葡萄糖濃度的M200培養(yǎng)

2、基培養(yǎng)4天;2)持續(xù)高糖組,30mM葡萄糖濃度的M200培養(yǎng)基培養(yǎng)4天;3)代謝記憶組:30mM葡萄糖濃度的M200培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后,轉為5.5mM葡萄糖濃度的M200培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)3天;4)滲透壓對照組:24.5mM甘露醇+5.5mM葡萄糖濃度的M200培養(yǎng)基作為滲透壓對照組持續(xù)培養(yǎng)4天。Wistar大鼠分為3組:1)正常對照組,飼養(yǎng)24周;2)糖尿病組,STZ誘導成模后飼養(yǎng)24周;3)代謝記憶組,STZ誘導成模后高糖狀態(tài)維持12周

3、,隨后使用胰島素控制血糖至正常范圍。檢測內(nèi)皮細胞及大鼠主動脈組織相關指標:內(nèi)皮細胞一氧化氮(NO)活性水平,前炎癥因子MCP-1、ICAM-1及IL-6mRNA的表達水平,細胞及組織內(nèi)活性氧水平,eNOSmRNA及蛋白的表達水平,以及eNOS(Ser-1177)的磷酸化水平。
　　結果:在人主動脈內(nèi)皮細胞及大鼠主動脈組織中,高糖導致NO水平持續(xù)下降,而前炎癥因子MCP-1、ICAM-1、IL-6mRNA的表達水平以及活性氧水平持續(xù)

4、升高,同時NOX活性也持續(xù)升高,即使血糖降至正常后仍然未恢復。抑制細胞內(nèi)eNOS活性則可降低細胞及組織中活性氧水平及前炎癥因子的表達,而且抑制細胞內(nèi)NOX活性可恢復細胞內(nèi)NO生物活性水平。我們進一步發(fā)現(xiàn):高糖導致eNOS持續(xù)高表達,而eNOS(Ser-1177)的磷酸化水平則持續(xù)下降,即使血糖降至正常后仍然未恢復。
　　結論:早期高血糖誘發(fā)了細胞內(nèi)氧化應激,持續(xù)損傷血管內(nèi)皮舒張功能,誘導前炎癥因子的持久高表達,導致持續(xù)的血管內(nèi)皮細

5、胞功能紊亂;而恢復正常血糖后,以上效應仍然持續(xù)。功能紊亂的eNOS持久高表達,成為活性氧的持續(xù)供體,在高血糖代謝記憶中發(fā)揮了重要作用;而NOX在誘發(fā)eNOS功能紊亂中發(fā)揮了重要作用。
　　目的:有研究表明高血糖導致血管損傷的關鍵靶基因發(fā)生了表觀遺傳學修飾,參與了高血糖“代謝記憶”效應的形成及發(fā)展。我們前期的研究也顯示早期高血糖導致內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因表達活性的持續(xù)改變。因此,我們推測高血糖導致了eNOS基因的表觀遺

6、傳學修飾發(fā)生了持久的改變,從而導致其表達活性的改變。本研究擬建立高血糖代謝記憶細胞模型,觀察eNOS基因的表觀遺傳學改變,并對其具體機制進行探討。
　　方法:高血糖代謝記憶人主動脈內(nèi)皮細胞分為4組,同:第一部分一致:1)正常對照組;2)持續(xù)高糖組;3)代謝記憶組;4)滲透壓對照組。采用電轉染法,向內(nèi)皮細胞轉染Set7特異性的ShRNA表達質(zhì)粒或者過表達質(zhì)粒,使內(nèi)皮細胞沉默Set7基因的表達或者過表達Set7基因。采用染色質(zhì)免疫共沉

7、淀技術(CHIP)檢測內(nèi)皮細胞表觀遺傳學修飾相關指標:eNOS基因啟動子區(qū)H3K4m1,H3K4m2,H3K4m3,H3K9m2及H3K4m3修飾水平以及set7在eNOS基因啟動子區(qū)富集水平。
　　結果:在人主動脈內(nèi)皮細胞中,前期短暫高糖導致eNOS基因表達持續(xù)增加,eNOS基因啟動子區(qū)H3K4m1修飾水平持續(xù)升高以及介導H3K4m1修飾的甲基轉移酶Set7含量增加,而H3K9m2及H3K9m3的修飾水平則持續(xù)下降,即使轉為正常

8、糖濃度培養(yǎng)仍不能逆轉這一變化。沉默細胞內(nèi)Set7基因的表達則可逆轉高糖導致eNOS基因表達的持續(xù)增加,逆轉eNOS基因啟動子區(qū)Set7含量的增加及上述表觀遺傳修飾的改變;而使內(nèi)皮細胞過表達Set7基因則得到相反的結果。
　　結論:早期高糖誘發(fā)了人主動脈內(nèi)皮細胞中內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因啟動子區(qū)表觀遺傳學修飾持久的改變,從而導致eNOS基因表達活性的持久改變,即使恢復正糖后仍未逆轉這一改變;而甲基轉移酶Set7介導了eN